Bitacora: UNIDAD 2 CULTIVO DE TEJIDOS VEGETAL

1. DATOS DE LA ASIGNATURA.

Nombre de la asignatura: Biotecnología

Aplicada

Carrera:lic.biologia

Clave de la asignatura: 3 – 2 – 9.

Horas teoría-horas práctica-créditos

2. HISTORIA DEL PROGRAMA

Lugar y fecha de elaboración o revisión	Participantes	Observaciones ( cambios y justificación)
Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano, del 15 de abril al 15 de mayo del 2009	Miembros de la academia de Biología	Diseño curricular de la especialidad de Agrobiología y definición de los programas de estudio

3. UBICACIÓN DE LA ASIGNATURA.

a) Relación con otras asignaturas del plan de estudios


Asignaturas	Temas	Asignaturas	Temas
ASIGNATURA	TEMAS
Matemáticas aplicadas a la biología	Conceptos basicos de medidas p/v, %. M/M, ppm, pH, entre otros
Biología celular	Componentes celulares, División celular, Diferenciación celular
Biología molecular	Bases moleculares de la duplicación y expresión genetica
Bioquímica	Trascripción, Traducción, Replicación
Microbiología	Identificación de hongos y bacterias, Asepsia
Fisiología vegetal	Relaciones hídricas, Nutrición, Crecimiento y desarrollo Reguladores de crecimiento
Bioestadística	Análisis de varianza, Correlación, Regresión lineal
Genética	Leyes de Mendel, Genoma, Reproducción asexual

b) Aportación de la asignatura al perfil del egresado

Contribuir con el desarrollo regional aplicando técnicas agrobiotecnológicas de vanguardia.

4. OBJETIVO (S) GENERAL (ES) DEL CURSO.

El alumno adquirirá los conocimientos, proyectara sus alcances y conocerá las limitaciones en la aplicación de técnicas biotecnológicas, en la propagación vegetal, Transformación bacteriana, vegetal y animal, diagnostico y mejoramiento.

5. TEMARIO.

Unidad	Temas	Subtemas
	I ntroducción	1.1. Generalidades 1.1.1. Reseña histórica de la biotecnologia 1.1.2. Bitecnologia de primera segunda y tercera generacion 1.1.3. Importancia: Económica, Ecológica y Agronómica. 1.2. terminología general de la biotecnología
2	Cultivo De Tejidos Vegetales	2. 1 Medios de cultivo 2. 1. 1. Áreas del laboratorio de cultivo de tejidos. 2. 1. 2. Material y equipo de laboratorio 2. 1. 3. generalidades de los medios de cultivo 2. 1. 4. Component. del medio de cultivo 2. 1. 5. Preparación y manejo de soluciones stock. 2. 1. 6. Preparación de los medios de cultivo. 2. 2. Esterilización 2. 2.1. Tipos de esterilización 2.2. Factores que intervienen en el proceso de esterilización. 2.3. Establecimiento El Cultivo De Tejidos 2.3.1. Etapas del cultivo de tejidos 2.3.2. Selección de plantas madres 2.3.3. Explante 2.3.4. Siembra del explante 2.3.5. Condiciones de incubación 2.3.6. Cambios fisiológicos del explante 2.3.7. Trasplante al sustrato
3	Tecnicas In Vitro En El Cultivo De Tejidos Vegetales	3.1. Generalidades 3.2. Micropropagación 3.3. Plantas libres de patógenos 3.4. Técnicas in Vitro aplicadas al fitomejoramiento 3.4.1. Producción de haploides: cultivo de anteras y ovulos 3.4.2. Variación somaclonal 3.4.3. Fusión de protoplastos 3.4.4. Aplicación agrobiologica 3.5 Conservacion In Vitro 3.5.1. aspectos importantes en la conservación in Vitro 3.5.1.1. Regeneracion 3.5.1.2. Variabilidad 3.5.1.3. Estabilidad genetica 3.5.1.4. Estrategias 3.5.2. Metodos de conservación 3.5.2.1. Factores que limitan el crecimiento 3.5.2.2. Supresión del crecimiento 3.5.2.3. Cryoconservacion del germoplasma
4	DNA Recombinante	4.1. Transformación de organismos 4.2. Corte y union de moléculas de ADN 4.2.1. enzimas de corte 4.2.2. enzimas de union 4.2.3. clonacion de genes 4.2.4. Vectores de clonacion 4.2.5. Tecnología de ADN Recombinante en la agricultura 4.2.5.1. Plantas transgénicas 4.2.5.2. animales transgénicos 4.3.legislación 4.4. Bioetica y revolucion biotecnologica
5	técnicas de diagnostico molecular biotecnología	5.1. Técnicas basadas en PCR y/o electroforesis 5.2. Southern 5.3. Northern 5.4. marcadores moleculares AFLP RAPD MICROSATELITES SECUENCIAS MITOCONDRIALES SECUENCIAS RIBOSOMALES Otros

6. APRENDIZAJES REQUERIDOS

Preparación de soluciones de químicas
División celular
Nutrición vegetal
Crecimiento y desarrollo vegetativo
Control de desarrollo de microorganismos
Factores físicos que afectan el crecimiento y desarrollo vegetal
Leyes de Mendel
Reacciones químicas de los procesos fisiológicos.

7. SUGERENCIAS DIDACTICAS.

· Realizar investigación documental.

· Realizar un análisis grupal sobre los temas.

· Realizar practicas de cultivos de tejidos y marcadores moleculares

· Uso de material audiovisual.

· Elaboración de cuadros sinópticos.

· Diseño de un vivero adecuado a las condiciones locales

· Exposición.

8. SUGERENCIAS DE EVALUACION

· Examen oral y/o escrito de los contenidos temáticos.

· Asistencia y reporte de prácticas.

· Tareas escolares.

· Participación en clase y en actividades de aprendizaje.

· Desempeño activo en las prácticas.

9. UNIDADES DE APRENDIZAJE

Unidad1. Introducción

Objetivo educacional	Actividades de aprendizaje	Fuentes de información.
Conocer el desarrollo histórico de la Biotecnología a nivel Nacional y Mundial, así como la terminología mas empleada.	Investigar las generalidades y antecedentes de la biotecnología.	1,2,3

Unidad 2. Cultivo De Tejidos Vegetales

Objetivo educacional	actividades de aprendizaje	fuentes de información.
Conocer el laboratorio, material y equipo mínimo indispensable en la preparación de los medios de cultivo. Conocer las diferentes técnicas de esterilización y su importancia en el cultivo de tejidos vegetales. Conocer las características adecuadas para la selección, manejo del explante para la siembra, así como las condiciones de incubación.	Realizar prácticas de preparación de soluciones nutritivas, medios de cultivo, esterilización y siembra aseptica de vegetales	1, 2,3,5

Unidad 3. Tecnicas In Vitro En El Cultivo De Tejidos Vegetales.

Objetivo educacional	actividades de aprendizaje	Fuentes de información.
Conocer y manejar adecuadamente las técnicas del cultivo de tejidos vegetales	Realizar un mapa conceptual con todas las técnicas utilizadas e el cultivo de tejidos vegetales.	1, 2,3,4,5

Unidad 4. DNA Recombinante

Objetivo educacional	Actividades de aprendizaje	Fuentes de información.
Conocer y describir la importancia y los alcances de la ingeniería genética asi como sus principales métodos.	Hacer investigación documental sobre las aplicaciones agrobiológicas del DNA recombinante	3,4

Unidad 5 . Técnicas de diagnostico molecular biotecnológico.

Objetivo educacional	Actividades de aprendizaje	Fuentes de información.
Conocer y describir la importancia y los alcances de la ingeniería genética asi como sus principales métodos.	I investigar técnicas de diagnostico y aplicación a problemas agrobiológicos del entorno.	3,4.

10. Fuentes de información.

1. Doods, H.J. and W.R. Ioron 1990. Experiment in Plant Tissue culture edition Cambridge University Pres,

USA

2. Lindsey K. and M. G. Jones 1992. Biotecnologia Vegetal agrícola. Ediciones Acribia, España.

3. Natell S.H. Mathews I. and Mckee R.A. 1995. Principles of plant Biotechnol.

4. Old. R.W. and Primrose S.B. 1987. Principios de manipulación Genética. 1 Ed. Acribia España.

5. Pierik R.L. 1991. Cultivo in Vitro de plantas superiores. 1 Ed. Mundiprensa España.

11. PRACTICAS PROPUESTAS.

Practica 1. Conocimiento del laboratorio de cultivo de tejidos vegetales

Practica 2. Conocimiento y manejo del material y equipo del laboratorio

Practica 3. Preparación de soluciones stock

Practica 4. preparación de medios de cultivo

Practica 5. Esterilización de medios de cultivo y material de cristalería

Practica 6. Selección de la planta madre

Practica 7. selección, desinfección y siembra del explante

Practica 8. Desinfección y esterilización del sustrato

Practica 9. Trasplante y Adaptación bajo condiciones de invernadero

Practica 10. Cultivo de raices

Practica 11. Cultivo de yemas

Practica 12. inducción de callogenesis

Practica 13. Cultivo de ápices

Practica 14. Cultivo de hojas

Practica 15. Cultivo de meristemos

Practica 16. Cultivo de embriones cigoticos

Practica 17. Microinjerto

Practica 18. Cultivo de anteras

Practica 19. Cultivo de óvulos

Practicas 20. Enrraizamiento in vitro

Practica 21. Extracción de DNA

Pratica 22. Digestión enzimatica de DNA y electrophoresis en agarosa

Practica 23. Diagnostico molecular por PCR

SEP SNEST DGEST

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

UNIDAD II

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETAL

YOLANDA ELIZABETH MORENO HERNÁNDEZ

08930254

CARRERA: LIC. BIOLOGÍA VIII

CIUDAD ALTAMIRANO, GRO. MÉXICO. FEBRERO DEL 2012

INTRODUCCIÓN

Dentro de la Biotecnología, el Cultivo de Tejidos Vegetales o Cultivo In Vitro, es una técnica de producción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles y millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre cuando a este tejido le es aplicado un estimulo por medio de variables físicas o químicas controladas en un medio de cultivo.

Permite obtener plantas libres de enfermedades (hongos, bacterias, micoplasmas, virus y tiroides).

OBJETIVOS

Conocer el laboratorio, material y equipo mínimo indispensable en la preparación de los medios de cultivo. Conocer las diferentes técnicas de esterilización y su importancia en el cultivo de tejidos vegetales. Conocer las características adecuadas para la selección, manejo del explante para la siembra, así como las condiciones de incubación

METODOLOGIA

2.1 MEDIOS DE CULTIVO

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que los organismos vegetales crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de los organismos requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

2. 1. 1. ÁREAS DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS.

El laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales se dedica a la micropropagación comercial de plantas a empresas o productores particulares. En se divide en diferentes aéreas de acuerdo a la función que desempeña.

2. 1. 2. MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO

2. 1. 3. GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo constituyen un elemento fundamental para el cultivo “in vitro” de células, tejidos, protoplastos, anteras y para lograr el desarrollo de embriones, embrioides, la organogénesis, la micropropagación, etc. Los medios de cultivo tienen una serie de componentes generales y específicos cuya presencia y concentración estará en dependencia del objetivo que se persiga en su utilización. Así, los medios de cultivo pueden ser líquidos o tener un soporte sólido, tienen sustancias minerales, vitaminas, aminoácidos, azúcares, fitohormonas, etc. También pueden contener por ejemplo extractos naturales, según su finalidad y debe quedar claro que no todos llevan un complemento completo de todos los factores.

2. 1. 4. COMPONENTE DEL MEDIO DE CULTIVO

en el cultivo in vitro de tejidos vegetales, se denomina solución madre o stock a cualquier solución de composición elevada y concentración definida, en la que el soluto puede ser uno o más compuestos químicos de los que conforman un determinado medio de cultivo y que mediante un proceso de dilución permita la preparación de 1 litro de medio de cultivo. (Pierik, 1990)Desde el punto de vista práctico la preparación de soluciones madres o stock tiene como finalidad evitar:Pesar cada uno de los compuestos químicos que constituyen un medio de cultivo, cada vez que se requiera elaborar, lo que implicaría evitar demasiado tiempo en su preparación.Inexactitud al pesar cantidades muy pequeñas de ciertos compuestos químicos.
Otro aspecto importante que se debe considerar es la cantidad de agua que se utilice para disolver las sales inorgánicas que constituyen las soluciones stock y en general el medio de cultivo.El agua debe ser destilada o bidestilada y necesariamente des ionizada. (Kyte & Kleyn, 1996)Se han creados numeroso medios de cultivos (medio basal), cuyas diferencias estriban en las cantidades y tipos de sales empleadas.Entre los medios de cultivo más conocidos se encuentran:

Murashige y Skoog (MS) (1962),
Linsmaier y Skoog (LS) (1965),
Borgin y Nitsch (BN) (1967),
Gamborg (B5) (1970),
Sachs (1860), Knop (1865),
Arnon y hoglan (1940),
Gautheret (1942), Riquer y Duggar (1946),
Heller (1953-58)
Nitsch y Nitsch (1956),
Torrey y Shigemura (1957-64),
White (1963),
Blaydes (1966),
Miller y Oyima (1968).

SALES INORGANICAS

MACRONUTRIENTES
Los elementos minerales son muy importantes para la vida de las plantas.

Nitrógeno (N): forma parte de aminoácidos, vitaminas, proteínas y ácidos nucleíco.
Magnesio (Mg): es parte de la molécula de clorofila y de los ribosomas
Calcio (Ca): Es constituyente de la pared celular. Interviene en respuesta de crecimiento,
Fosforo (P): Forma parte de las moléculas que almacenan y transfieren la energía química de los ácidos nucleicos, de este depende la energía celular.
Potasio (K): Desempeña un papel importante en la regulación osmótica y en la actividad enzimática.Azufre (S): Necesario para sintetizar algunos aminoácidos

Sodio (Na): Es necesario en el cultivo in vitro de halófilas y en plantas cuyos productos fotosintéticos son C4 y plantas con metabolismo acido. (García, 2000)

Micronutrientes
Estos micronutrientes son importantes en las células vegetales, ya que al adicionarles ciertas cantidades excesivamente pequeñas permite que las sales madres sean mas eficaz para el medio de cultivo.
Hierro (Fe): forma el núcleo del citocromo y parte de la ferrodoxina.
Molibdato (Mo): fundamental para la actividad de la nitroreductasa
Manganeso (Mn): induce a la síntesis de clorofila, se requiere para la formación del O2 en la fotosíntesis.

Boro (B): Necesario para el sostenimiento de la actividad meristematica, involucrado en la síntesis de bases nitrogenadas como el uracilo.
— Cobre (Cu): permite la oxidación respiratoria final, esta ligado al proceso de lignificación.

— Zinc (Zn): requerido para la oxidación e hidroxilación de compuestos fenolicos.

— Cobalto (Co): componente de la vitamina B12

— Cloro (Cl): fundamental en reacciones que llevan a la evolución del O2 en la fotosíntesis. (García, 2000)

REGULADORES DE CRECIMIENTOS

Adicionalmente a los nutrientes, generalmente es necesario agregar una o más sustancias reguladoras; frecuentemente Auxinas y/o Citoquininas, pero a veces también Giberelinas o ácido ascórbico, para mejorar el desarrollo del cultivo in vitro de tejidos y órganos. Por otro lado, los requerimientos de estas sustancias varían considerablemente con los tipos de tejidos y los niveles endógenos de estos reguladores, así como con la finalidad del cultivo in vitro.

El uso de fitoreguladores en los cultivos in vitro es de gran importancia por cuanto Se ha demostrado que la clase y concentración de dichas sustancias interactúan con el genoma de la planta. (Montoya, 1991)

Auxinas

Son utilizadas principalmente para la diferenciación de raíces y la inducción de callo. Las más utilizadas son:

IBA: (ácido indol-3-butírico) = diferenciación de raíces
ANA: (ácido naftalenacético) = diferenciación de raíces
IAA: (ácido indolacético) = Prolongación de explantes
2,4-D: (ácido diclorofenoxiacético) = inducción de callos.

(Las Auxinas se disuelven usualmente en etanol diluido o en una solución de hidróxido de sodio).

Citoquininas

Promueve la división celular y la inducción de yemas adventicias en callos y órganos. Brotación.
— Las Citoquininas más usadas son:
— BAP: (bencilamino purina)
— Kinetina
— 2-ip (isopentenil-adenina).
(Generalmente son diluidas con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio).

Giberelinas

Su función principal es alargar las regiones subapicales del explante. La giberelina con mayor uso es: El GA3: pero se debe tener en cuenta que es muy sensible al calor (pierde el 90% de su actividad después del autoclavado)

Comparado con las Auxinas y Citoquininas, las giberelinas se utilizan raramente. La mayoría de los explantes sintetizan cantidades suficientes de este grupo de hormonas.

Acido abscísico

El ácido abscísico (ABA) en la mayor parte de los casos produce un efecto negativo en los cultivos in vitro, pero en determinados casos promueve la maduración de embriones, y en cultivos de células en suspensión facilita la sincronización de la división celular.

Etileno:Interviene en procesos como: liberación de la dormancia, crecimiento y diferenciación de brotes y raíces, formación de raíces adventicias, abscisión de hojas, flores y frutos, inducción de floración en algunas plantas, senescencia de hojas, flores y maduración de frutos.

Vitaminas:La mayor parte de las plantas sintetizan casi todas las vitaminas esenciales, pero aparentemente lo hacen en cantidades infraóptimas. Para lograr un buen crecimiento es necesario a menudo suplir al medio con una o más vitaminas.
La tiamina (B1) es la que más se utiliza y se la considera un ingrediente esencial. Otras vitaminas también han demostrado tener un efecto positivo en el crecimiento in vitro, como son: pidiroxina (B6), ácido nicotínico (B3), pantotenato cálcico (B5).

Fuentes de carbono:Normalmente para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos es necesario adicionar una fuente de carbono en el medio, debido a que el crecimiento in vitro tiene lugar en condiciones poco apropiadas para la fotosíntesis o incluso en oscuridad.

La sacarosa es la más utilizada para propósitos de Micropropagacion.
Generalmente se usan concentraciones de 1 -6% de sacarosa en el medio, aquí es convertida rápidamente en glucosa y fructosa; la glucosa es la que primero se utiliza seguida de la fructosa.El azúcar blanco refinado que se vende en los supermercados puede resultar adecuado para la Micropropagación en muchos casos.

Azucares

Los azucares en el medio cumplen dos funciones esenciales:

— Son fuentes de energía.
— Mantienen en el medio un potencial osmótico determinado.

AGENTES GELIFICANTES

Agar: Es una mezcla de polisacáridos extraídos de un alga marina. Tiene una elevada masa molecular, como también la capacidad de hidratarse y formar una red. La planta no puede digerirlo ni absorberlo, además no interactúa con los componentes nutritivos del medio. El Agar se funde a altas temperaturas (1000C), solidifica alrededor de los 400C y no se degrada con la luz. Generalmente se utiliza a una concentración de 0,6 - 1%. El principal problema con este gelificante es su elevado costo.
Gelrita: Es un heteropolisacárido aniónico natural producido por una bacteria, que forma geles semejantes al Agar. Se puede usar a una concentración de 0,15-0,30%. Los geles de gelrita son notablemente más claros que los de Agar, y también cuajan más rápidamente. (García, 2000)

2. 1. 5. PREPARACIÓN Y MANEJO DE SOLUCIONES STOCK.

Muchos métodos de análisis cuantitativo de materiales biológicos se basan en la separación de la sustancia en cuestión (presente en tales materiales) y su conversión química a una molécula capaz de absorber energía radiante. Si el producto en solución absorbe luz en la región visible del espectro, la solución será coloreada. La intensidad del color se usa como una medida de la concentración del producto disuelto y permite calcular la concentración de sustancia presente en el material biológico original. Por lo tanto revisaremos brevemente los principios involucrados para realizar estos tipos de análisis.

Las soluciones stock pueden prepararse y almacenarse en frio por largo tiempo, para lo cual se recomienda el uso de recipientes con tapa de vidrio. Todas estas soluciones
deben prepararse con agua destilada.A continuaciòn se describen tres medios de cultivo
para algas de agua dulce:
1. Beijerinck ( pH 6.8 ): Se compone de 3 soluciones stock de macronutrientes y una de micronutrientes.
Soluciones stock de macronutrientes
TIPO CANTIDAD
Stock I (para 100 ml / l )
NO3 NH 4 1,5 g / l
PO4
HK2 0,2 g / l
SO4 Mg . 7 H2O 0,2 g / l
Cl
2Ca . 2 H2O 0,1 g / l
Stock II ( para 40 ml / l )
PO4
H 2
K 9,07 g / l
Stock III ( para 60 ml / l )
PO4
HK2 11,66

Solución stock de micronutrientes
TIPO CANTIDAD
Micronutrientes ( para 1 ml / l )
BO3H3 1 g / l
SO4
Cu . 5H2O 0,15 g / l
EDTA . Na
2 5 g / l
SO4Zn . 7 H2O 2,2 g / l
Cl
2Mn . 4 H2 O 0,15 g / l
Mo7O24 ( NH4)6. 4 H2O 0,10 g /

Solución stock
NUTRIENTE CANTIDAD
( NO3 )2
Ca 0,04 g / l
PO4 HK2
0,01 g / l
SO4Mg. 7H2O 0,025 g / l
CO3Na2
0,02 g / l
SiO3Na2
0,025 g / l
Cl3
Fe 0,8 g / l
Recomendaciones
Los medios enriquecidos tienen la ventaja de so

2. 1. 6. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

Para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos hay una serie de factores que hay que tener en cuenta. El medio de cultivo debe tener los nutrientes necesarios para que las células vegetales puedan desarrollarse con normalidad: sales inorgánicas, una fuente de carbono en el caso de no poder realizar fotosíntesis, vitaminas en algunos casos y fitohormonas.

El medio inorgánico más empleado es la mezcla de sales diseñada por Murashige y Skoog (MS). Este medio se puede completar con glucosa, vitaminas, auxinas y/o citoquininas para el cultivo de distintos tipos de tejidos y células.

En la práctica vamos a preparar un medio de cultivo para la obtención de callos de explantos de plantas de tabaco. Prepararemos medios de cultivo con distintas relaciones de auxina/citoquinina que determinan, según los casos, mayor desarrollo de la parte aérea o mayor desarrollo de la raíz.

Medio de cultivo básico

Medio MS: Es un preparado comercial que contiene las distintas sales mezcladas y listas para ser disueltas en medio líquido. Cuando se disuelven en la cantidad adecuada, la concentración final de los distintos nutrientes minerales es la mostrada en la Tabla 1.

Tabla 1. Concentración de sales minerales de la disolución nutritiva diseñda por Murashige-Skoog

Sales de macronutrientes (mg·L^-1)		Sales de micronutrientes (mg·L^-1)
NH₄NO₃	1650	KI	0.83
KNO₃	1900	H₃BO₃	6.2
CaCl₂·2H₂O	440	MnSO₄·4H₂O	22.3
MgSO₄·7H₂O	370	ZnSO₄·7H₂O	8.6
KH₂PO₄	170	Na₂MoO₄·2H₂O	0.25
		CuSO₄·5H₂O	0.025
		CoCl₂·6H₂O	0.025
		Na₂·EDTA	37.3

Dicho medio básico hay que suplementarlo con diversos componentes. Las vitaminas están preparadas en disoluciones concentradas stock, que, al ser termolábiles, se esterilizan por filtración:

· Vitaminas (termolábiles, STOCK 1000 v.c.):

1. Ácido nicotínico 5 mg·L^-1

2. Tiamina hidrocloruro 5 mg·L^-1

3. Piridoxina hidrocloruro 1 mg·L^-1

· Mio-inositol 1 g·L^-1

· Sacarosa 3 %

· Para medio sólido: agar (Phytogel, Sigma) 0.8 %

Medio de cultivo con fitohormonas y kanamicina

Para comprobar el efecto de una aplicación exógena de hormonas sobre el desarrollo del explanto vamos a preparar distintos medios de cultivo, donde la concentración de fitohormonas será distinta, siguiendo el esquema de la Tabla 2. Se parte de disoluciones stock concentradas, que se añadirán para preparar 500 mL de medio por grupo. Este volumen de medio es suficiente para preparar al menos 20 placas Petri por grupo.

· Auxina (termolábil, STOCK 1000 v.c.): ácido naftalénacético (NAA) 3 g·L^-1

· Citoquinina (termolábil, STOCK 1000 v.c.): bencilaminopurina (BAP) 1 g·L^-1

· Kanamicina (termolábil, STOCK 1000 v.c.): 50 g L^-1

Tabla 2. Medios de cultivo a preparar por los distintos grupos de trabajo, en los que se variará la proporción de fitohormonas y la presencia o ausencia de kanamicina. Los volúmenes de los stock de fitohormonas se han calculado para preparar 500 mL de medio de cultivo.

Medio	Kan	Conc. final (mg·L^-1) auxina:citoquinina	NAA	BAP	Kan	Grupo
	(mg L^-1)		(µL)
Alta auxina (AA)	NO	3.0 : 0.0	500	0	0	1
Media aux. (MA)	NO	1.5 : 0.5	250	250	0	2
Baja aux. (BA)	NO	0.5 : 3.0	85	1500	0	3
AA + kanamicina	50	3.0 : 0.0	500	0	500	4
MA + kanamicina	50	1.5 : 0.5	250	250	500	5
BA + kanamicina	50	0.5 : 3.0	85	1500	500	6

Aparatos, instrumental y material vario

Autoclave	Pinzas y bisturíes	Balanza
Placas Petri estériles Fitotrón (22ºC-17ºC, 16h luz-8h oscuridad) Tijeras	Pipetas automáticas Puntas pipetas estériles pHmetro Mechero Bunsen	Pulgas magnéticas Agitador magnético Tubos Falcon Frascos ISO de 1 L

1.2. Metodología cultivo in vitro

Se prepararán las placas con medio de cultivo sólido. En primer lugar se procederá a la preparación de 500 mL de medio de cultivo líquido MS por grupo (Cada mesa tendrá los cuatro tratamientos indicados). Las sales inorgánicas (macronutrientes y micronutrientes) vienen mezclados en un preparado comercial (Sigma, M-5524). En un vaso de precipitado que contenga aproximadamente 400 mL de H₂O desionizada, se disuelven 2.15 g del preparado comercial. Seguidamente se añaden 15 g de sacarosa y 0.5 g de mio-inositol. Una vez disueltos los solutos, la disolución se ajusta a pH 6.0 y se enrasa el volumen a 500 mL. En una botella de 1 L (Duran, tapón azul) se echan 4 g de Phytogel y se vierte con cuidado los 500 mL del medio que se ha preparado. Se autoclavan en ciclo corto 121ºC a 105 kPa durante 20 min.

una vez autoclavados los medios, se tienen que enfriar hasta alcanzar unos 60ºc. esta temperatura permite coger los matraces con la mano, no tienen que quemar al tacto. cuando ha alcanzado la temperatura adecuada, se procede a la adición de los componentes termolábiles que han sido esterilizados previamente por filtración. se añaden los correspondientes volúmenes de las disoluciones stock: vitaminas 0.5 ml, fitohormonas o kanamicina según se indica en la tabla 2. siempre cuidando de trabajar muy cerca del mechero encendido, manteniendo la boca de la botella cerca de la llama, y siempre trabajar con la mayor presteza posible.

una vez añadidos los componentes necesarios, la botella se agita por rotación para homogeneizar la mezcla, y con la mayor presteza hay que plaquear antes de que se solidifique el agar.

se prepararán 15-20 placas petri con los 500 ml de medio de cultivo estrilizado. hay que evitar dejar las placas abiertas. cuanto más cuidado se ponga en este paso, menos problemas de contaminación habrá.

las placas se dejan solidificar, se cierran con una tira de prafilm y ya estarán listas para el día siguiente.

dia 2

se procederá a recolectar los tejidos a cultivar in vitro de plantas de tabaco silvestre y transgénico. se cortarán secciones de tallo y hojas con bisturí, que seguidamente se transferirán a tubos falcon de 50 ml para su esterilización.

esterilización

se añade 15-20 ml de etanol 70%, agitando suavemente durante 3 min. se enjuaga el tejido con agua estéril y se lava el tejido con otros 15-20 ml de la disolución esterilizadora durante 5 min. para eliminar la lejía, se lava el tejido con tres volúmenes de h₂o desionizada estéril, trabajando siempre cerca del mechero.

mucho, mucho cuidado con el etanol y el mechero. es altamente inflamable y no queremos tener bajas en la tropa!!

una vez esterilizado el tejido, y trabajando con presteza y mucho cuidado, se cortarán más finamente los tallos en secciones de aproximadamente 0,5 cm de espesor. seguidamente, se transfieren a las placas petri con unas pinzas que hayan sido flameadas, apoyando los sectores sobre el agar. finalmente, las placas hay que sellarlas con parafilm.

por favor, insistimos en el cuidado que debeis tener para que se trabaje con la mayor limpieza y esterilidad posibles

dejaremos el material en el fitotrón. cada 5-7 días se observará el progreso del experimento, y cuando pasen 3-4 semanas podremos observar el desarrollo final de los explantos, a los que se tomarán fotografías.

se prepararán las placas con medio de cultivo sólido. en primer lugar se procederá a la preparación de 500 ml de medio de cultivo líquido ms por grupo (cada mesa tendrá los cuatro tratamientos indicados). las sales inorgánicas (macronutrientes y micronutrientes) vienen mezclados en un preparado comercial (sigma, m-5524). en un vaso de precipitado que contenga aproximadamente 400 ml de h₂o desionizada, se disuelven 2.15 g del preparado comercial. seguidamente se añaden 15 g de sacarosa y 0.5 g de mio-inositol. una vez disueltos los solutos, la disolución se ajusta a ph 6.0 y se enrasa el volumen a 500 ml. en una botella de 1 l (duran, tapón azul) se echan 4 g de phytogel y se vierte con cuidado los 500 ml del medio que se ha preparado. se autoclavan en ciclo corto 121ºc a 105 kpa durante 20 min.

una vez añadidos los componentes necesarios, la botella se agita por rotación para homogeneizar la mezcla, y con la mayor presteza hay que plaquear antes de que se solidifique el agar.

las placas se dejan solidificar, se cierran con una tira de prafilm y ya estarán listas para el día siguiente.

Bitacora

jueves, 9 de febrero de 2012

UNIDAD 2 CULTIVO DE TEJIDOS VEGETAL

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