domingo, 26 de febrero de 2012

practica 1




SUBSECRETARÍA DE EDUCACIÓN SUPERIOR
DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN  SUPERIOR TECNOLÓGICA





QUE PRESENTA:
ALFREDO ORTIZ MARTÍNEZ
YOLANDA E. MORENO HERNÁNDEZ
HELMER MARTÍNEZ CASARRUBIAS
MA. ALEYDA LÓPEZ HARRISON
ELIDENE PÉREZ QUINTANA




 















                   
                      
                                                        Cd. Altamirano, Guerrero. México. Febrero 20 del 2012




AGRADECIMIENTOS

A dios por permitirnos seguir adelante con cada uno de nuestros propósitos con respecto a nuestra carrera, ya que en momentos difíciles siempre está para apoyarnos cuando más lo necesitamos.

A nuestros padres ya que sin su apoyo incondicional no estaríamos ahora estudiando una licenciatura y la manera de animarnos a seguir estudiando para tener un futuro mejor.

A nuestros hermanos que, siempre están allí en las buenas y malas para ayudarnos y darnos ánimos de seguir luchando y seguir adelante para cumplir con cada uno de nuestros objetivos.

A  nuestra escuela el IT de cd Altamirano por facilitarnos el espacio para llevar a cabo cada uno de los procedimientos de investigación y aprendizaje que se requieren en dicha asignatura, así como el material y equipo de laboratorio que se utiliza en el transcurso de cada práctica.

Al M.C. Francisco Javier Puche Acosta por ser nuestro motor de aprendizaje ya que sin su apoyo, la práctica sería muy difícil de llevarla a cabo, también se le agradece el soportar debilidades de laboratorio, de cada uno de sus alumnos.







RESUMEN

La presente práctica tuvo como objetivo conocer las diferentes áreas y equipos básicos de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales. El laboratorio donde se realizo dicha práctica fue en el IT de cd Altamirano ubicado en la región de Tierra Caliente del municipio de Pungarabato de cd Altamirano, Guerrero. Se realizo a cabo la identificación de áreas con el fin de conocer esas áreas que son específicamente necesarias y que cuentan con el material y equipo adecuado para realizar lo que es el cultivo de tejidos in vitro. El cultivo in vitro esta técnica consiste en la micropropagación de plantas por medio de tejidos o pequeños órganos en condiciones asépticas, teniendo la ventaja de  acelerar el proceso de propagación de una especie.








ÍNDICE

                 Apartado                                                                                 N° de página

I.              Antecedentes…………………………………………………….. 5 - 7

II.            Definición del problema………………………………………….8


III.           Objetivos…………………………………………………………...9
3.1  General
3.2  Especifico

IV.          Justificación……………………………………………………….10

V.           Fundamento teórico………………………………………………11 - 12


VI.          Materiales y métodos……………………………………………..13

VII.         Resultados………………………………………………………...14 - 15


VIII.       Conclusiones y recomendaciones……………………………...16

IX.          Fuentes consultadas……………………………………………..17


X.           Anexos……………………………………………………………..18





I. ANTECEDENTES

La ciencia ha estado evolucionando a una velocidad tan increíble que los avances tecnológicos deben satisfacer las necesidades que aparecen al transcurrir de los años. Por ello es tan importante dar a conocer estos supuestos teóricos para que puedan ser tomados como apoyo en la elaboración de un laboratorio que va a estar a la altura de los requerimientos establecidos por las  leyes y para la aplicación de muchos proyectos de biotecnología para el desarrollo del conocimiento científico.
En el año 1984, el Ministerio de Agricultura y Ganadería a través de la Dirección de Investigación y Extensión Agropecuaria y Forestal con la Cooperación de la Agencia Internacional de Desarrollo, dispuso la creación del primer laboratorio de cultivo de tejidos del país en el Instituto Agronómico Nacional de Caacupé.
El avance logrado por las ciencias biológicas, en las últimas dos décadas se han desarrollado técnicas que posibilitan el estudio de las plantas a nivel celular y molecular. Estos nuevos enfoques, conocidos colectivamente como biotecnología se están convirtiendo en herramientas poderosas para el mejoramiento de las plantas y el progreso de la agricultura. El cultivo de tejidos es importante no solo porque es el área de la biotecnología que mayor aplicación práctica, en la agricultura, sino por ser herramienta versátil para el estudio de los problemas básicos y aplicados en la biología de las plantas. Constituye, en efecto, el puente necesario para llevar las manipulaciones genéticas desde el laboratorio hasta el campo. Actualmente, con las nuevas instalaciones construidas por el Ministerio de Agricultura y Ganadería, y con los equipamientos donados por diversas cooperaciones internacionales, el Laboratorio cuenta con la infraestructura necesaria para emprender trabajos de investigación en Cultivo de Tejidos, así como la producción de vitroplantas de especies de interés agrícola, operando como una biofábrica.
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como cualquier lugar de trabajo, los laboratorios de biotecnología y de tipo biológico han de reunir unas condiciones, que si bien pueden variar notablemente en función de su finalidad Para definir las distintas condiciones ambientales que los laboratorios de biotecnología y de tipo biológico deben reunir conforme a lo establecido en las disposiciones legales vigentes, se han tenido en cuenta las actividades que se realizan en dichas dependencias de la UPV, sobre la base documental de las actuaciones llevadas a cabo por el Servicio de Prevención de Riesgos Laborales de la UPV, con el apoyo de las visitas realizadas a las diferentes instalaciones. A este respecto, se pueden considerar las siguientes actividades laborales:
El laboratorio de biotecnología comenzó su desarrollo a mediados de la década del 80, estableciéndose por entonces un primer laboratorio de cultivo de tejido en el Centro experimental La Platina para  realizar micropropagación de arándano y otras especies hortofrutícolas, termoterapia para liberación de  virus, conservación de germoplasma exótico y nativo, etc.
Este laboratorio se fue complementado con el equipamiento requerido para trabajar en biología molecular, hasta que el año 1993 se comenzó con la aplicación de marcadores moleculares para distintos tipos de análisis genético en plantas.  Originalmente, esta iniciativa estuvo dirigida a establecer un grupo de trabajo central en esta estación experimental, que pudiera desarrollar líneas de investigación avanzada, sirviendo de soporte para los requerimientos de los distintos programas de mejoramiento genético distribuidos a lo largo del INIA (Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria) y disciplinas como fitopatología y recursos genéticos, entre otras.  Paralelamente, por ese tiempo se verificó una modificación en la estrategia operacional del INIA, lo que significó que algunos Centros Regionales conformaran sus propios grupos de trabajo y laboratorios de Biotecnología, destacando Carillanca en Temuco y Quilamapu en Chillán.  Particularmente en Carillanca se ha establecido desde hace algunos años un laboratorio completamente equipado, donde se trabaja en todos los ámbitos de la biotecnología agropecuaria, mientras que en Quilamapu los esfuerzos se han centrado en especies forestales, además de cultivos agrícolas. 
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En octubre de 1994, se inició la operación de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales in vitro, en el Colegio Profesional de Biólogos del Estado de Veracruz A.C. con la finalidad de desarrollar técnicas para la propagación de especies vegetales de interés ecológico y económico. En enero de 1995, se iniciaron las labores de siembra de tejidos en especies ornamentales de interés económico en la región. A la par de estas actividades, se ha hecho promoción del proyecto en los medios de comunicación locales con el fin de dar a conocer al público las ventajas de utilizar la técnica mencionada para la propagación de plantas ornamentarles difíciles de obtener por los métodos tradicionales.

II. DEFINICIÓN DE PROBLEMA

La falta de un laboratorio en un espacio individual exclusivamente para la biotecnología,  hace muy difícil los procesos biotecnológicos y prácticas necesarias para el cultivo in vitro de plantas.




  


  
III. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

        Conocer las diferentes áreas y equipos básicos de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.



3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

   I  indentificación de principales áreas del laboratorio para cultivo de tejidos.

      Determinación de un área de incubación dentro del laboratorio del IT de Cd Altamirano.







  






IV. JUSTIFICACIÓN

El contar con todas las áreas esenciales para lo que es un laboratorio de biotecnología es de gran utilidad e importancia para el aprendizaje requerido y obtenido en cada una de las áreas. Así pues tenemos que la presente práctica busca el conocer e identificar cada una de las áreas especificas para la realización de cultivos in vitro, además de buscar que brinden los materiales y equipo necesario para llevar a cabo cada una de las prácticas. El trabajo realizado brinda el conocimiento de conocer con las áreas que cuenta el laboratorio del IT de Cd Altamirano para el conocimiento y forjamiento de cada uno de los procesos biotecnológicos que se llevaran a cabo en el transcurso del tiempo.









V. FUNDAMENTO TEÓRICO

5.1 Laboratorio de biotecnología vegetal
La biotecnología vegetal es una serie de técnicas y procesos que permiten el cultivo y modificación en el laboratorio de las plantas o de partes de ellas (células, tejidos u órganos). Esto con el fin de multiplicarlas masivamente, hacerlas mejores, más productivas u obtener productos útiles a partir de ellas. Las dos ramas más importantes dentro de la biotecnología vegetal son el cultivo de tejidos vegetales y la ingeniería genética de plantas. La biotecnología vegetal es una de las herramientas más valiosas que se tienen actualmente para el mejoramiento y conservación de las plantas que sostienen la vida humana.

5.2 Importancia del laboratorio de cultivo in vitro
La importancia de los laboratorios tanto en la enseñanza de las ciencias como en la investigación y en la industria es, sin duda alguna, indiscutible. No se puede negar que el trabajo práctico en laboratorio proporciona la experimentación y el descubrimiento y evita el concepto de “resultado correcto” que se tiene cuando se aprenden de manera teórica, es decir, sólo con los datos procedentes de los libros. Sin embargo, el uso de laboratorios requiere de tiempo adicional al de una clase convencional, por ejemplo, para descubrir y aprender de los propios errores. En términos generales, un laboratorio es un lugar equipado con diversos instrumentos para uso biotecnológico en este caso del cultivo in vitro de plantas ya que por medio de la propagación in vitro se pueden obtener grandes cantidades de plantas que contribuye a la conservación de éstas eh aquí la importancia del laboratorio de cultivo in vitro.

5.3 Reconocimiento de un laboratorio para cultivo in vitro

El contar con un laboratorio especializado principalmente para el cultivo in vitro es de gran importancia pues gracias al material y equipo que lo conforman se pueden llevar a cabo sin ningún problema  cada uno de los procedimientos necesarios para el cultivo in vitro y por ende tener una masiva propagación de plantas, ya que es de esto principalmente de lo que se trata. Cabe entonces mencionar que las áreas que se deben identificar si no se cuenta con un laboratorio especializado para el uso exclusivo de cultivo in vitro, por lo menos se debe de contar con las siguiente áreas: área de esterilización, área de lavado, área de incubación, área de reactivos, área de siembra. El laboratorio de cultivo in vitro está dedicado especialmente a lo que es la propagación de plantas, la enseñanza del docente a estudiantes para enriquecer los conocimientos, para investigaciones, entre otros aspectos importantes.

5.4 Cultivo in vitro
El cultivo in vitro, micropropagación o propagación vegetal in vitro, es el cultivo de  células, tejidos u órganos de plantas en un medio aséptico que le aporta los nutrientes necesarios para su desarrollo. En este medio y con algunas condiciones físicas y químicas apropiadas, las células tienen la habilidad de desarrollarse, desdiferenciarse, producir metabolitos, multiplicarse y hasta regenerar un organismo entero" (Dodds & Roberts, 1985), en cuyo caso, la nueva planta será genéticamente idéntica a la planta madre, y su desarrollo se dará en un periodo de tiempo mucho más corto. Así pues, para lograr cualquiera de estos propósitos se debe iniciar con la utilización de pequeñas muestras de tejidos vegetales (explante) que tras una adecuada desinfección superficial, son transferidos asépticamente a medios nutritivos líquidos o semisólidos y almacenados bajo  condiciones ideales de temperatura y fotoperíodicidad que garanticen un rápido desarrollo.  



 VI. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1 El laboratorio (espacio para cultivo in vitro)
El laboratorio es sin duda alguna un espacio especializado para llevar a cabo prácticas y procedimientos de interés académico, científico, y para contribuir a investigaciones y enseñanzas del docente. Se cuenta con un laboratorio no especializado pero si de utilidad para lo que es la biotecnología aplicada, con ello se puede de alguna manera llevar a cabo cada uno de los procedimientos necesarios para lo que el cultivo de plantas in vitro, ya que de alguna manera se puede acondicionar con lo que se tenga al alcance y de alguna manera conocer cada una de las funciones de las áreas con las que cuenta el laboratorio, así como el conocimiento y manejo adecuado de cada uno de los instrumentos, materiales y equipos con los que cuenta cada área en especifico. El laboratorio se ubica en las instalaciones de la escuela superior IT de cd Altamirano y este ah sido identificado como un área específica para llevar a cabo los procedimientos y técnicas del cultivo in vitro.

6.2 Identificación de las áreas de laboratorio para el cultivo in vitro
Se identificaron claramente algunas de las áreas para llevar a cabo cada uno de los procedimientos para el cultivo in vitro. Las siguientes fueron las áreas identificadas en el laboratorio:
1.    ÁREA DE PREPARACIÓN: refrigerador, balanza, potenciómetro, frascos Erlenmeyer.
2.    ÁREA DE ESTERILIZACIÓN: en esta área se cuenta con una olla express para llevar a cabo la esterilización de materiales y medios de cultivo.
3.    ÁREA DE LAVADO: gradillas para secado, bandejas de aluminio y de plástico de varios tamaños, recipientes de plástico grandes.
4.    ÁREA DE REACTIVOS
5.    ÁREA DE EXAMINACIÓN: microscopios.
6.    ÁREA DE TRANSFERECIA
7.    ÁREA DE INCUBACIÓN



VII. RESULTADOS

Los resultados obtenidos para dicha práctica fueron satisfactorios pues se logró identificar claramente algunas de las áreas que pueden contribuir para llevar a cabo cada uno de los procedimientos necesarios para realizar cultivos in vitro, además se observo que cada una de las áreas contienen materiales tanto de vidrio y de plástico y demás.
La primera área identificada fue el área de preparación la cual consta de mesas de metal, balanza, además de poseer espacios para material de cristal y plástico y demás para los fines útiles que se requieran. Enseguida se identifico el área de esterilización que cuenta con una olla express en la que se esterilizan materiales de vidrio y los medios de cultivo. Por consiguiente se identifico el área de lavado que cuenta con escurridores, lavadero en el que se lavan aquellos materiales que se encuentra sucios, bandejas de aluminio y plástico en los que se colocan instrumentos de metal como pinzas, navajas entre otros. Posteriormente se identifico el área de reactivos en cual resguarda lo que son las sales y otros reactivos. El laboratorio cuenta también con microscopios compuestos que usualmente son utilizados para el área de exanimación. Con respeto al área de transferencia se cuenta con una campana de flujo laminar horizontal donde se realizaría la excisión, inoculación y transferencia de explantes a los medios de cultivo.



















VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

   La identificación adecuada de las áreas de un laboratorio de cultivo in vitro son necesarias para llevar a cabo los procedimientos requeridos para el aprendizaje, manejo y evaluación de los cultivos in vitro.

     Conocer la importancia de un laboratorio como espacio ideal para llevar a cabo investigaciones y enseñanza académica es de gran utilidad para engrandecer el conocimiento del alumno.

     El manejo y conocimiento adecuado de cada uno de los materiales, equipo, reactivos que forman parte de cada una de las áreas de laboratorio de cultivo in vitro se hacen esenciales para una mayor comprensión en el procedimiento de dicha práctica.

  A pesar de la deficiencia del laboratorio para biotecnología se pudo acondicionar e identificar aquellas áreas que bien se pueden ocupar para los requerimientos biotecnológicos.

    El laboratorio del IT de cd Altamirano necesita un espacio exclusivamente para el área de biotecnología, aunque cuenta con las áreas para llevar a cabo procedimientos biotecnológicos, es necesario un espacio individual.

      Es necesario que se cuente con un espacio bastante ordenado, con las áreas especificas y no un laboratorio revuelto ya que no es lo más factible y no tiene buen visto.

     Las futuras generaciones deben de saber reconocer, trabajar y dar todo de ellos al máximo si es que aún no se cuenta con el espacio individual y adecuado para llevara a cabo los procedimientos de biotecnología como los cultivos in vitro.




  

IX. FUENTES CONSULTADAS

Libro electrónico


*      Montilla De Bravo, Fernández s & colaboradores. 1997. El cultivo de piña en Venezuela. Fondo Nacional de Investigaciones Agropecuarias. Pág. 108

Páginas electrónicas

*      http://farmacia.udea.edu.co/~biotecnolab/Manual%20de%20laboratorio%20de%20Biotecnolog%EDa%20recortado.pdf

*      http://www.angelfire.com/hi/odeon/Laboratorio_1.PDF


*      http://www.uaa.mx/investigacion/revista/archivo/revista20/Articulo%207.pdf

*      http://www.inia.cl/biotecnologia/publicaciones/Biotec_INIA.pdf


*      http://fw3.abc.com.py/suplementos/rural/articulos.php?pid=254011

*      http://www.monografias.com/trabajos35/laboratorio-biotecnologia/laboratorio-biotecnologia.shtml










X. ANEXOS

Imagen ilustrativa de un laboratorio especifico para la biotecnología


soluciones stock ( halogenos )


jueves, 9 de febrero de 2012

UNIDAD 2 CULTIVO DE TEJIDOS VEGETAL




1.    DATOS DE LA ASIGNATURA.

      

          Nombre de la asignatura: Biotecnología
                Aplicada
           Carrera:lic.biologia

          Clave de la asignatura: 3 – 2 – 9.

          Horas teoría-horas práctica-créditos

2.    HISTORIA DEL PROGRAMA

Lugar y fecha de elaboración o revisión
      Participantes
 Observaciones ( cambios y justificación)
  Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano, del 15 de abril al 15 de mayo del 2009
   Miembros de la academia de Biología
    Diseño curricular de la especialidad de Agrobiología  y definición de los programas de estudio

3.    UBICACIÓN DE LA ASIGNATURA.
a)    Relación con otras asignaturas del plan de estudios




      Asignaturas
     Temas
     Asignaturas
    Temas
     ASIGNATURA
    TEMAS


      Matemáticas aplicadas a la biología
      Conceptos basicos de medidas p/v, %. M/M, ppm, pH, entre otros


      Biología celular
        Componentes celulares, División celular, Diferenciación celular


      Biología molecular
      Bases moleculares de la duplicación y expresión genetica


      Bioquímica
      Trascripción, Traducción, Replicación


      Microbiología
      Identificación de hongos y bacterias, Asepsia


      Fisiología vegetal
      Relaciones hídricas, Nutrición, Crecimiento y desarrollo
      Reguladores de crecimiento


      Bioestadística
      Análisis de varianza, Correlación, Regresión lineal


      Genética
     Leyes de Mendel, Genoma, Reproducción asexual





b)    Aportación de la asignatura al perfil del egresado

Contribuir con el desarrollo regional aplicando técnicas agrobiotecnológicas de vanguardia.

4.    OBJETIVO (S) GENERAL (ES) DEL CURSO.

El alumno adquirirá los conocimientos, proyectara sus alcances y conocerá las limitaciones en la aplicación de técnicas biotecnológicas, en la propagación vegetal, Transformación bacteriana, vegetal y animal, diagnostico y mejoramiento.



5.     TEMARIO.

         Unidad
          Temas            
    Subtemas
I         ntroducción                                   
       1.1.      Generalidades
       1.1.1.    Reseña histórica de la biotecnologia
       1.1.2.    Bitecnologia de primera segunda y tercera generacion
       1.1.3.    Importancia: Económica, Ecológica y Agronómica.
        1.2.      terminología general de la biotecnología

      2
     Cultivo De Tejidos                           Vegetales                     
2.            1 Medios de cultivo
       2. 1. 1. Áreas del laboratorio de cultivo de tejidos.
       2. 1. 2. Material y equipo de laboratorio
       2. 1. 3. generalidades de los medios de cultivo
       2. 1. 4. Component. del medio de cultivo
       2. 1. 5. Preparación y manejo de soluciones stock.
       2. 1. 6. Preparación de los medios de cultivo.
       2. 2. Esterilización
       2. 2.1. Tipos de esterilización
      2.2.    Factores que intervienen en el proceso de esterilización.
        2.3. Establecimiento El Cultivo De Tejidos
        2.3.1. Etapas del cultivo de tejidos
        2.3.2. Selección de plantas madres
        2.3.3. Explante
        2.3.4. Siembra del explante
        2.3.5. Condiciones de incubación
       2.3.6. Cambios fisiológicos del explante
       2.3.7. Trasplante al sustrato
      3
     Tecnicas In Vitro En El Cultivo De Tejidos Vegetales     
      3.1. Generalidades
      3.2. Micropropagación
      3.3. Plantas libres de patógenos
      3.4. Técnicas in Vitro aplicadas al fitomejoramiento
      3.4.1. Producción de haploides: cultivo de anteras y ovulos
      3.4.2. Variación somaclonal
      3.4.3. Fusión de protoplastos
      3.4.4. Aplicación agrobiologica
      3.5 Conservacion In Vitro
      3.5.1. aspectos importantes en la conservación in Vitro
      3.5.1.1. Regeneracion
      3.5.1.2. Variabilidad
      3.5.1.3. Estabilidad genetica
      3.5.1.4. Estrategias
      3.5.2. Metodos de conservación
      3.5.2.1. Factores que limitan el crecimiento
      3.5.2.2. Supresión del crecimiento
      3.5.2.3. Cryoconservacion del germoplasma
       4                        
     DNA Recombinante
       4.1. Transformación de organismos
       4.2. Corte y union de moléculas de ADN
       4.2.1. enzimas de corte
       4.2.2. enzimas de union
       4.2.3. clonacion de genes
       4.2.4. Vectores de clonacion
       4.2.5. Tecnología de ADN Recombinante en la agricultura
       4.2.5.1. Plantas transgénicas
       4.2.5.2. animales transgénicos
       4.3.legislación
       4.4. Bioetica y revolucion biotecnologica

       5                
        técnicas de  diagnostico molecular                          biotecnología 
       5.1. Técnicas basadas en PCR y/o electroforesis
       5.2. Southern
       5.3. Northern
       5.4. marcadores moleculares
       AFLP
       RAPD
       MICROSATELITES
      SECUENCIAS MITOCONDRIALES
      SECUENCIAS RIBOSOMALES
      Otros



6.     APRENDIZAJES REQUERIDOS

  •      Preparación de soluciones de químicas
  •       División celular
  •      Nutrición vegetal
  •      Crecimiento y desarrollo vegetativo
  •      Control de desarrollo de microorganismos
  •       Factores físicos que afectan el crecimiento y desarrollo vegetal
  •      Leyes de Mendel
  •      Reacciones químicas de los procesos fisiológicos.
.

7.     SUGERENCIAS DIDACTICAS.
·         Realizar investigación documental.
·          Realizar un análisis grupal sobre los temas.
·         Realizar practicas de cultivos de tejidos y marcadores moleculares
·         Uso de material audiovisual.
·         Elaboración de cuadros sinópticos.
·          Diseño de un vivero adecuado a las condiciones locales
·           Exposición.

8.     SUGERENCIAS DE EVALUACION
·         Examen oral y/o escrito de los contenidos temáticos.
·         Asistencia y reporte de prácticas.
·         Tareas escolares.
·         Participación en clase y en actividades de aprendizaje.
·         Desempeño activo en las prácticas.


9.     UNIDADES DE APRENDIZAJE

Unidad1. Introducción


       Objetivo educacional
       Actividades de aprendizaje
          Fuentes de información.
      Conocer el desarrollo histórico de la Biotecnología a nivel Nacional y Mundial, así como la terminología mas empleada.


        Investigar las generalidades y                          antecedentes de la biotecnología.
       1,2,3


Unidad 2. Cultivo De Tejidos Vegetales

       Objetivo educacional                                      
      actividades    de               aprendizaje
            fuentes de información.
     Conocer el laboratorio, material y equipo mínimo indispensable en la preparación de los medios de cultivo. Conocer las diferentes técnicas de esterilización y su importancia en el cultivo de tejidos vegetales. Conocer las características adecuadas para la selección, manejo del explante para la siembra, así como las condiciones de incubación.
       Realizar prácticas de preparación de soluciones nutritivas, medios de cultivo, esterilización y siembra aseptica de vegetales


1,    2,3,5

                     Unidad 3. Tecnicas In Vitro En El Cultivo De Tejidos Vegetales.
     Objetivo educacional                  
    actividades de aprendizaje
     Fuentes de información.
    Conocer y manejar adecuadamente las técnicas del cultivo de tejidos vegetales

    Realizar un mapa conceptual con todas las técnicas utilizadas e el cultivo de tejidos vegetales.

1,      2,3,4,5
                    
                  Unidad 4. DNA Recombinante
     Objetivo educacional
     Actividades de aprendizaje
     Fuentes de información.
     Conocer y describir la importancia y los alcances de la ingeniería genética asi como sus principales métodos.
    Hacer investigación documental sobre las aplicaciones agrobiológicas del DNA recombinante

          3,4


                  Unidad 5 . Técnicas de diagnostico molecular biotecnológico.
           Objetivo educacional
         Actividades de aprendizaje
        Fuentes de información.
   Conocer y describir   la importancia y los alcances de la ingeniería genética asi como sus principales métodos.
I     investigar técnicas de diagnostico y aplicación a problemas agrobiológicos del entorno.
              3,4.
                 
                                                                                               

10. Fuentes de información.

1.  Doods, H.J. and W.R. Ioron 1990. Experiment in Plant Tissue culture edition Cambridge University Pres, USA.
2. Lindsey K. and M. G. Jones 1992. Biotecnologia Vegetal agrícola. Ediciones Acribia, España.
3. Natell S.H. Mathews I. and Mckee R.A. 1995. Principles of plant Biotechnol.
4. Old. R.W. and Primrose S.B. 1987. Principios de manipulación Genética. 1 Ed. Acribia España.
5. Pierik R.L. 1991. Cultivo in Vitro de plantas superiores. 1 Ed. Mundiprensa España.


11. PRACTICAS PROPUESTAS.

Practica 1. Conocimiento del laboratorio de cultivo de tejidos vegetales
Practica 2. Conocimiento y manejo del material y equipo del laboratorio
Practica 3. Preparación de soluciones stock
Practica 4. preparación de medios de cultivo
Practica 5. Esterilización de medios de cultivo y material de cristalería
Practica 6. Selección de la planta madre
Practica 7. selección, desinfección y siembra del explante
Practica 8. Desinfección y esterilización del sustrato
Practica 9. Trasplante y Adaptación bajo condiciones de invernadero
Practica 10. Cultivo de raices
Practica 11. Cultivo de yemas
Practica 12. inducción de callogenesis
Practica 13. Cultivo de ápices
Practica 14. Cultivo de hojas
Practica 15. Cultivo de meristemos
Practica 16. Cultivo de embriones cigoticos
Practica 17. Microinjerto
Practica 18. Cultivo de anteras
Practica 19. Cultivo de óvulos
Practicas 20. Enrraizamiento in vitro
Practica 21. Extracción de DNA
Pratica 22. Digestión enzimatica de DNA y electrophoresis en agarosa
Practica 23. Diagnostico molecular por PCR

























































                     SEP                      SNEST                      DGEST



   INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO




                                                      
                                                                   UNIDAD II

                                               CULTIVO DE TEJIDOS VEGETAL
 
                                     YOLANDA ELIZABETH MORENO HERNÁNDEZ
                                                                     08930254




CARRERA: LIC. BIOLOGÍA VIII

CIUDAD ALTAMIRANO, GRO. MÉXICO. FEBRERO DEL 2012


                                                          INTRODUCCIÓN

Dentro de la Biotecnología, el Cultivo de Tejidos Vegetales o Cultivo In Vitro, es una técnica de producción en condiciones totalmente asépticas, en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible regenerar en poco tiempo miles y millones de plantas genéticamente iguales a la planta madre cuando a este tejido le es aplicado un estimulo por medio de variables físicas o químicas controladas en un medio de cultivo.
Permite obtener plantas libres de enfermedades (hongos, bacterias, micoplasmas, virus y tiroides).

                                                             OBJETIVOS
Conocer el laboratorio, material y equipo mínimo indispensable en la preparación de los medios de cultivo. Conocer las diferentes técnicas de esterilización y su importancia en el cultivo de tejidos vegetales. Conocer las características adecuadas para la selección, manejo del explante para la siembra, así como las condiciones de incubación

                                                           METODOLOGIA


   2.1 MEDIOS DE CULTIVO


Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que los organismos vegetales crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de los organismos requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.




2. 1. 1. ÁREAS DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS.
El laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales se dedica a la micropropagación comercial de plantas a empresas o productores particulares. En se divide en diferentes aéreas de acuerdo a la función que desempeña.






2. 1. 2. MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO







2. 1. 3. GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
MEDIOS DE CULTIVO


Los medios de cultivo constituyen un elemento fundamental para el cultivo “in vitro” de células, tejidos, protoplastos, anteras y para lograr el desarrollo de embriones, embrioides, la organogénesis, la micropropagación, etc. Los medios de cultivo tienen una serie de componentes generales y específicos cuya presencia y concentración estará en dependencia del objetivo que se persiga en su utilización. Así, los medios de cultivo pueden ser líquidos o tener un soporte sólido, tienen sustancias minerales, vitaminas, aminoácidos, azúcares, fitohormonas, etc. También pueden contener por ejemplo extractos naturales, según su finalidad y debe quedar claro que no todos llevan un complemento completo de todos los factores.

2. 1. 4. COMPONENTE  DEL MEDIO DE CULTIVO

en el cultivo in vitro de tejidos vegetales, se denomina solución madre o stock a cualquier solución de composición elevada y concentración definida, en la que el soluto puede ser uno o más compuestos químicos de los que conforman un determinado medio de cultivo y que mediante un proceso de dilución permita la preparación de 1 litro de medio de cultivo. (Pierik, 1990)Desde el punto de vista práctico la preparación de soluciones madres o stock tiene como finalidad evitar:Pesar cada uno de los compuestos químicos que constituyen un medio de cultivo, cada vez que se requiera elaborar, lo que implicaría evitar demasiado tiempo en su preparación.Inexactitud al pesar cantidades muy pequeñas de ciertos compuestos químicos.
Otro aspecto importante que se debe considerar es la cantidad de agua que se utilice para disolver las sales inorgánicas que constituyen las soluciones stock y en general el medio de cultivo.El agua debe ser destilada o bidestilada y necesariamente des ionizada. (Kyte & Kleyn, 1996)Se han creados numeroso medios de cultivos (medio basal), cuyas diferencias estriban en las cantidades y tipos de sales empleadas.Entre los medios de cultivo más conocidos se encuentran: 

Murashige y Skoog (MS) (1962),
Linsmaier y Skoog (LS) (1965),
Borgin y Nitsch (BN) (1967),
Gamborg (B5) (1970),
Sachs (1860), Knop (1865),
Arnon y hoglan (1940),
Gautheret (1942), Riquer y Duggar (1946),
Heller (1953-58)
Nitsch y Nitsch (1956),
Torrey y Shigemura (1957-64),
White (1963),
Blaydes (1966),
Miller y Oyima (1968).

SALES INORGANICAS

MACRONUTRIENTES
Los elementos minerales son muy importantes para la vida de las plantas.

Nitrógeno (N): forma parte de aminoácidos, vitaminas, proteínas y ácidos nucleíco.
Magnesio (Mg): es parte de la molécula de clorofila y de los ribosomas
Calcio (Ca): Es constituyente de la pared celular. Interviene en respuesta de crecimiento,
Fosforo (P): Forma parte de las moléculas que almacenan y transfieren la energía química de los ácidos nucleicos, de este depende la energía celular.
Potasio (K): Desempeña un papel importante en la regulación osmótica y en la actividad enzimática.Azufre (S): Necesario para sintetizar algunos aminoácidos

Sodio (Na): Es necesario en el cultivo in vitro de halófilas y en plantas cuyos productos fotosintéticos son C4 y plantas con metabolismo acido. (García, 2000)

Micronutrientes
Estos micronutrientes son importantes en las células vegetales, ya que al adicionarles ciertas cantidades excesivamente pequeñas permite que las sales madres sean mas eficaz para el medio de cultivo.
Hierro (Fe): forma el núcleo del citocromo y parte de la ferrodoxina.
Molibdato (Mo): fundamental para la actividad de la nitroreductasa
Manganeso (Mn): induce a la síntesis de clorofila, se requiere para la formación del O2 en la fotosíntesis.

Boro (B): Necesario para el sostenimiento de la actividad meristematica, involucrado en la síntesis de bases nitrogenadas como el uracilo.
— Cobre (Cu): permite la oxidación respiratoria final, esta ligado al proceso de lignificación.

— Zinc (Zn): requerido para la oxidación e hidroxilación de compuestos fenolicos.

— Cobalto (Co): componente de la vitamina B12

— Cloro (Cl): fundamental en reacciones que llevan a la evolución del O2 en la fotosíntesis. (García, 2000)

REGULADORES DE CRECIMIENTOS

Adicionalmente a los nutrientes, generalmente es necesario agregar una o más sustancias reguladoras; frecuentemente Auxinas y/o Citoquininas, pero a veces también Giberelinas o ácido ascórbico, para mejorar el desarrollo del cultivo in vitro de tejidos y órganos. Por otro lado, los requerimientos de estas sustancias varían considerablemente con los tipos de tejidos y los niveles endógenos de estos reguladores, así como con la finalidad del cultivo in vitro.

El uso de fitoreguladores en los cultivos in vitro es de gran importancia por cuanto Se ha demostrado que la clase y concentración de dichas sustancias interactúan con el genoma de la planta. (Montoya, 1991)

Auxinas

Son utilizadas principalmente para la diferenciación de raíces y la inducción de callo. Las más utilizadas son:

IBA: (ácido indol-3-butírico) = diferenciación de raíces
ANA: (ácido naftalenacético) = diferenciación de raíces
IAA: (ácido indolacético) = Prolongación de explantes
2,4-D: (ácido diclorofenoxiacético) = inducción de callos.

(Las Auxinas se disuelven usualmente en etanol diluido o en una solución de hidróxido de sodio).

Citoquininas

Promueve la división celular y la inducción de yemas adventicias en callos y órganos. Brotación.
— Las Citoquininas más usadas son:
— BAP: (bencilamino purina) 
— Kinetina
— 2-ip (isopentenil-adenina).
(Generalmente son diluidas con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio).

Giberelinas

Su función principal es alargar las regiones subapicales del explante. La giberelina con mayor uso es: El GA3: pero se debe tener en cuenta que es muy sensible al calor (pierde el 90% de su actividad después del autoclavado)

Comparado con las Auxinas y Citoquininas, las giberelinas se utilizan raramente. La mayoría de los explantes sintetizan cantidades suficientes de este grupo de hormonas.

Acido abscísico

El ácido abscísico (ABA) en la mayor parte de los casos produce un efecto negativo en los cultivos in vitro, pero en determinados casos promueve la maduración de embriones, y en cultivos de células en suspensión facilita la sincronización de la división celular.

Etileno:Interviene en procesos como: liberación de la dormancia, crecimiento y diferenciación de brotes y raíces, formación de raíces adventicias, abscisión de hojas, flores y frutos, inducción de floración en algunas plantas, senescencia de hojas, flores y maduración de frutos. 

Vitaminas:La mayor parte de las plantas sintetizan casi todas las vitaminas esenciales, pero aparentemente lo hacen en cantidades infraóptimas. Para lograr un buen crecimiento es necesario a menudo suplir al medio con una o más vitaminas.
La tiamina (B1) es la que más se utiliza y se la considera un ingrediente esencial. Otras vitaminas también han demostrado tener un efecto positivo en el crecimiento in vitro, como son: pidiroxina (B6), ácido nicotínico (B3), pantotenato cálcico (B5).

Fuentes de carbono:Normalmente para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos es necesario adicionar una fuente de carbono en el medio, debido a que el crecimiento in vitro tiene lugar en condiciones poco apropiadas para la fotosíntesis o incluso en oscuridad.

La sacarosa es la más utilizada para propósitos de Micropropagacion.
Generalmente se usan concentraciones de 1 -6% de sacarosa en el medio, aquí es convertida rápidamente en glucosa y fructosa; la glucosa es la que primero se utiliza seguida de la fructosa.El azúcar blanco refinado que se vende en los supermercados puede resultar adecuado para la Micropropagación en muchos casos.

Azucares

Los azucares en el medio cumplen dos funciones esenciales:

— Son fuentes de energía.
— Mantienen en el medio un potencial osmótico determinado.


AGENTES GELIFICANTES

Agar: Es una mezcla de polisacáridos extraídos de un alga marina. Tiene una elevada masa molecular, como también la capacidad de hidratarse y formar una red. La planta no puede digerirlo ni absorberlo, además no interactúa con los componentes nutritivos del medio. El Agar se funde a altas temperaturas (1000C), solidifica alrededor de los 400C y no se degrada con la luz. Generalmente se utiliza a una concentración de 0,6 - 1%. El principal problema con este gelificante es su elevado costo.
Gelrita: Es un heteropolisacárido aniónico natural producido por una bacteria, que forma geles semejantes al Agar. Se puede usar a una concentración de 0,15-0,30%. Los geles de gelrita son notablemente más claros que los de Agar, y también cuajan más rápidamente. (García, 2000)


2. 1. 5. PREPARACIÓN Y MANEJO DE SOLUCIONES STOCK.


Muchos métodos de análisis cuantitativo de materiales biológicos se basan en la separación de la sustancia en cuestión (presente en tales materiales) y su conversión química a una molécula capaz de absorber energía radiante. Si el producto en solución absorbe luz en la región visible del espectro, la solución será coloreada. La intensidad del color se usa como una medida de la concentración del producto disuelto y permite calcular la concentración  de sustancia presente en el material biológico original. Por lo tanto revisaremos brevemente los principios involucrados para realizar estos tipos de análisis.





Las soluciones stock pueden prepararse y almacenarse en frio por largo tiempo, para lo cual se recomienda el uso de recipientes con tapa de vidrio. Todas estas soluciones
deben prepararse con agua destilada.A continuaciòn se describen tres medios de cultivo
para algas de agua dulce:
1.  Beijerinck ( pH 6.8 ):  Se compone de 3 soluciones stock de macronutrientes y una de micronutrientes.
Soluciones stock de macronutrientes
TIPO CANTIDAD
Stock I (para 100 ml / l )
NO3 NH 4 1,5 g / l
PO4
 HK2 0,2 g / l
SO4 Mg . 7 H2O 0,2 g / l
Cl
2Ca . 2 H2O 0,1 g  / l
Stock II ( para 40 ml / l )
PO4
 H 2
 K 9,07 g / l
Stock III ( para 60 ml / l )
PO4
 HK2 11,66




Solución stock de micronutrientes
TIPO CANTIDAD
Micronutrientes ( para 1 ml / l )
BO3H3 1 g / l
SO4
 Cu . 5H2O 0,15 g / l
EDTA . Na
2 5 g / l
SO4Zn . 7 H2O 2,2 g / l
Cl
2Mn . 4 H2 O 0,15 g / l
Mo7O24 ( NH4)6. 4 H2O 0,10 g / 




Solución stock
NUTRIENTE CANTIDAD
( NO3 )2
 Ca 0,04 g / l
PO4 HK2
0,01 g / l
SO4Mg. 7H2O 0,025 g / l
CO3Na2
0,02 g / l
SiO3Na2
0,025 g / l
Cl3
Fe 0,8   g / l
Recomendaciones
Los medios enriquecidos tienen la ventaja de so






2. 1. 6. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.


Para el cultivo in vitro de células, tejidos u órganos hay una serie de factores que hay que tener en cuenta. El medio de cultivo debe tener los nutrientes necesarios para que las células vegetales puedan desarrollarse con normalidad: sales inorgánicas, una fuente de carbono en el caso de no poder realizar fotosíntesis, vitaminas en algunos casos y fitohormonas.

El medio inorgánico más empleado es la mezcla de sales diseñada por Murashige y Skoog (MS). Este medio se puede completar con glucosa, vitaminas, auxinas y/o citoquininas para el cultivo de distintos tipos de tejidos y células.

En la práctica vamos a preparar un medio de cultivo para la obtención de callos de explantos de plantas de tabaco. Prepararemos medios de cultivo con distintas relaciones de auxina/citoquinina que determinan, según los casos, mayor desarrollo de la parte aérea o mayor desarrollo de la raíz.


Medio de cultivo básico
Medio MS: Es un preparado comercial que contiene las distintas sales mezcladas y listas para ser disueltas en medio líquido. Cuando se disuelven en la cantidad adecuada, la concentración final de los distintos nutrientes minerales es la mostrada en la Tabla 1.

Tabla 1. Concentración de sales minerales de la disolución nutritiva diseñda por Murashige-Skoog
Sales de macronutrientes (mg·L-1)
Sales de micronutrientes (mg·L-1)
NH4NO3
1650
KI
0.83
KNO3
1900
H3BO3
6.2
CaCl2·2H2O
440
MnSO4·4H2O
22.3
MgSO4·7H2O
370
ZnSO4·7H2O
8.6
KH2PO4
170
Na2MoO4·2H2O
0.25


CuSO4·5H2O
0.025


CoCl2·6H2O
0.025


Na2·EDTA
37.3


Dicho medio básico hay que suplementarlo con diversos componentes. Las vitaminas están preparadas en disoluciones concentradas stock, que, al ser termolábiles, se esterilizan por filtración:

·         Vitaminas (termolábiles, STOCK 1000 v.c.):
1.      Ácido nicotínico 5 mg·L-1
2.      Tiamina hidrocloruro 5 mg·L-1
3.      Piridoxina hidrocloruro 1 mg·L-1

·         Mio-inositol 1 g·L-1
·         Sacarosa 3 %
·         Para medio sólido: agar (Phytogel, Sigma) 0.8 %

Medio de cultivo con fitohormonas y kanamicina
Para comprobar el efecto de una aplicación exógena de hormonas sobre el desarrollo del explanto vamos a preparar distintos medios de cultivo, donde la concentración de fitohormonas será distinta, siguiendo el esquema de la Tabla 2. Se parte de disoluciones stock concentradas, que se añadirán para preparar 500 mL de medio por grupo. Este volumen de medio es suficiente para preparar al menos 20 placas Petri por grupo.

·         Auxina (termolábil, STOCK 1000 v.c.): ácido naftalénacético (NAA) 3 g·L-1
·         Citoquinina (termolábil, STOCK 1000 v.c.): bencilaminopurina (BAP) 1 g·L-1
·         Kanamicina (termolábil, STOCK 1000 v.c.): 50 g L-1

Tabla 2. Medios de cultivo a preparar por los distintos grupos de trabajo, en los que se variará la proporción de fitohormonas y la presencia o ausencia de kanamicina. Los volúmenes de los stock de fitohormonas se han calculado para preparar 500 mL de medio de cultivo.
Medio
Kan
Conc. final (mg·L-1)
auxina:citoquinina
NAA
BAP
Kan
Grupo

(mg L-1)

(µL)

Alta auxina (AA)
NO
3.0 : 0.0
500
0
0
1
Media aux. (MA)
NO
1.5 : 0.5
250
250
0
2
Baja aux. (BA)
NO
0.5 : 3.0
85
1500
0
3
AA + kanamicina
50
3.0 : 0.0
500
0
500
4
MA + kanamicina
50
1.5 : 0.5
250
250
500
5
BA + kanamicina
50
0.5 : 3.0
85
1500
500
6




Aparatos, instrumental y material vario
Autoclave
Pinzas y bisturíes
Balanza
Placas Petri estériles
Fitotrón (22ºC-17ºC, 16h luz-8h oscuridad)
Tijeras
Pipetas automáticas
Puntas pipetas estériles
pHmetro
Mechero Bunsen
Pulgas magnéticas
Agitador magnético
Tubos Falcon
Frascos ISO de 1 L

1.2. Metodología cultivo in vitro

Se prepararán las placas con medio de cultivo sólido. En primer lugar se procederá a la preparación de 500 mL de medio de cultivo líquido MS por grupo (Cada mesa tendrá los cuatro tratamientos indicados). Las sales inorgánicas (macronutrientes y micronutrientes) vienen mezclados en un preparado comercial (Sigma, M-5524). En un vaso de precipitado que contenga aproximadamente 400 mL de H2O desionizada, se disuelven 2.15 g del preparado comercial. Seguidamente se añaden 15 g de sacarosa y 0.5 g de mio-inositol. Una vez disueltos los solutos, la disolución se ajusta a pH 6.0 y se enrasa el volumen a 500 mL. En una botella de 1 L (Duran, tapón azul) se echan 4 g de Phytogel y se vierte con cuidado los 500 mL del medio que se ha preparado. Se autoclavan en ciclo corto 121ºC a 105 kPa durante 20 min.




una vez autoclavados los medios, se tienen que enfriar hasta alcanzar unos 60ºc. esta temperatura permite coger los matraces con la mano, no tienen que quemar al tacto. cuando ha alcanzado la temperatura adecuada, se procede a la adición de los componentes termolábiles que han sido esterilizados previamente por filtración. se añaden los correspondientes volúmenes de las disoluciones stock: vitaminas 0.5 ml, fitohormonas o kanamicina según se indica en la tabla 2. siempre cuidando de trabajar muy cerca del mechero encendido, manteniendo la boca de la botella cerca de la llama, y siempre trabajar con la mayor presteza posible.

una vez añadidos los componentes necesarios, la botella se agita por rotación para homogeneizar la mezcla, y con la mayor presteza hay que plaquear antes de que se solidifique el agar.

se prepararán 15-20 placas petri con los 500 ml de medio de cultivo estrilizado. hay que evitar dejar las placas abiertas. cuanto más cuidado se ponga en este paso, menos problemas de contaminación habrá.

las placas se dejan solidificar, se cierran con una tira de prafilm y ya estarán listas para el día siguiente.


dia 2

se procederá a recolectar los tejidos a cultivar in vitro de plantas de tabaco silvestre y transgénico. se cortarán secciones de tallo y hojas con bisturí, que seguidamente se transferirán a tubos falcon de 50 ml para su esterilización.

esterilización
se añade 15-20 ml de etanol 70%, agitando suavemente durante 3 min. se enjuaga el tejido con agua estéril y se lava el tejido con otros 15-20 ml de la disolución esterilizadora durante 5 min. para eliminar la lejía, se lava el tejido con tres volúmenes de h2o desionizada estéril, trabajando siempre cerca del mechero.

mucho, mucho cuidado con el etanol y el mechero. es altamente inflamable y no queremos tener bajas en la tropa!!

una vez esterilizado el tejido, y trabajando con presteza y mucho cuidado, se cortarán más finamente los tallos en secciones de aproximadamente 0,5 cm de espesor. seguidamente, se transfieren a las placas petri con unas pinzas que hayan sido flameadas, apoyando los sectores sobre el agar. finalmente, las placas hay que sellarlas con parafilm.

por favor, insistimos en el cuidado que debeis tener para que se trabaje con la mayor limpieza y esterilidad posibles

dejaremos el material en el fitotrón. cada 5-7 días se observará el progreso del experimento, y cuando pasen 3-4 semanas podremos observar el desarrollo final de los explantos, a los que se tomarán fotografías.


se prepararán las placas con medio de cultivo sólido. en primer lugar se procederá a la preparación de 500 ml de medio de cultivo líquido ms por grupo (cada mesa tendrá los cuatro tratamientos indicados). las sales inorgánicas (macronutrientes y micronutrientes) vienen mezclados en un preparado comercial (sigma, m-5524). en un vaso de precipitado que contenga aproximadamente 400 ml de h2o desionizada, se disuelven 2.15 g del preparado comercial. seguidamente se añaden 15 g de sacarosa y 0.5 g de mio-inositol. una vez disueltos los solutos, la disolución se ajusta a ph 6.0 y se enrasa el volumen a 500 ml. en una botella de 1 l (duran, tapón azul) se echan 4 g de phytogel y se vierte con cuidado los 500 ml del medio que se ha preparado. se autoclavan en ciclo corto 121ºc a 105 kpa durante 20 min.

una vez autoclavados los medios, se tienen que enfriar hasta alcanzar unos 60ºc. esta temperatura permite coger los matraces con la mano, no tienen que quemar al tacto. cuando ha alcanzado la temperatura adecuada, se procede a la adición de los componentes termolábiles que han sido esterilizados previamente por filtración. se añaden los correspondientes volúmenes de las disoluciones stock: vitaminas 0.5 ml, fitohormonas o kanamicina según se indica en la tabla 2. siempre cuidando de trabajar muy cerca del mechero encendido, manteniendo la boca de la botella cerca de la llama, y siempre trabajar con la mayor presteza posible.

una vez añadidos los componentes necesarios, la botella se agita por rotación para homogeneizar la mezcla, y con la mayor presteza hay que plaquear antes de que se solidifique el agar.

se prepararán 15-20 placas petri con los 500 ml de medio de cultivo estrilizado. hay que evitar dejar las placas abiertas. cuanto más cuidado se ponga en este paso, menos problemas de contaminación habrá.

las placas se dejan solidificar, se cierran con una tira de prafilm y ya estarán listas para el día siguiente.