UINIDAD 3

unida 2

           2 .2.1. Tipos de esterilización

 MÉTODOS FÍSICOS:

Calor

La utilización de este método y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposición y la temperatura.

Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.

2.1 Fuego Directo: Este procedimiento consiste en exponer a la llama de un mechero de Bunsen el objeto que se desea esterilizar. Cuando éste es de metal se deja permanecer en el área de reducción de la llama hasta que se ponga al rojo (asas de cultivo; algunas agujas, etc) . Si es de vidrio se deja un tiempo prudencial, procurando que la llama llegue a todos lados. Antes de utilizar el objeto esterilizado es necesario dejarlo enfriar en un sitio aséptico. Este procedimiento tiene limitaciones debido a que deteriora los objetos y si son de gran volumen, la esterilización nunca es perfecta.

2.2 Calor Seco: El calor seco produce desecación de la célula, esto es tóxico por niveles elevados de electrolitos y fusión de membranas, residuos que quedan adheridos al objeto estéril. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos.

Aún así se sigue utilizando el calor seco en todos los laboratorios para la esterilización de placas de petri y pipeteros (recipientes metálicos para alojar pipetas para la siembra de sustancias líquidas).

La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos componentes o nutrientes de los microorganismos, requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja.

2.3 Estufas: Para esterilizar por intermedio del aire caliente es necesario colocar los objetos

en aparatos especiales llamados ESTUFAS. Y llevar el aire interior a una temperatura entre 150 y 190 °C. Uno de los primeros aparatos utilizados para este fin fué el horno de Pasteur, que luego se sustituyó por estufas de aire caliente. Estas constan de una doble cámara, el aire caliente generado por unaresistencia eléctrica circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperaturas vatriables, siendo la más aconsejadas 170º C para el instrumental metálico y a 140º C para el contenido de los tambores. Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal denominados de par bimetálico, consistente en dos metales de distinto coeficiente de dilatación. Cuando uno se dilata, el otro no lo hace y se arquea. Uno de los extremos de éste dispositivo se halla en contacto con un interruptor que corta la alimentación de la resistencia calefactora.

UN AVANCE EN EL CONTROL DE TEMPERATURA: En la actualidad la mayoría de las estufas de esterilización o de cultivo se termorregulan por medio de un termostato hidráulico que consiste en una ampolla metálica con gas en su interior, hermética, unida por medio de un capilar de metal a un tambor que varía su volumen cuando aumenta la temperatura. Este tambor está en contacto con una llave interruptora, de manera que si el gas interior del tambor se dilata por el calor, la llave a la que está unido interrumpe el fluido eléctrico a la resistencia, manteniendo así la temperatura de la cámara.

MODERNIZACIÓN EN EL DISPOSITIVO DE CONTROL DE TEMPERATURA: Se ha logrado controlar la temperatura mediante un circuito electrónico que utiliza el microprocesador 555, utilizando como sensor una termorresistencia. Esta baja la resistencia a la corriente al aumentar la temperatura y la señal es enviada al procesador, el que corta un relé que alimenta la corriente de la resistencia de calefacción. Tanto éste como otros dispositivos electrónicos ofrecen extrema sensibilidad de control, ya apto mas para estufas de cultivo que para esterilización.

Ventajas del calor seco:

• No es corrosivo para metales e instrumentos.

• Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias viscosas no volátiles.

Atmósferas	Grados Centígrados
0	100
1/2	112
1	120
1 1/2	128
2	135

• Rápido calentamiento y penetración

• Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo

• No deja residuos tóxicos

• Hay un bajo deterioro del material expuesto

• Económico

• No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua

• Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.

Antisépticos	Alcoholes
	Iodo
	Agentes catiónicos, aniónicos y anfóteros
	Organo Mercuriales
	Colorantes
Desinfectantes y/o Esterilizantes	Cloro y Compuestos clorados
	Aldehídos
	Oxido de Etileno
	Compuestos Fenólicos
	Acidos y Alcalis

• El tipo de radiación

• El tiempo de exposición

• La dosis

3. Mezcla de Gérard

3. Mezcla de Gérard

Desventajas:

*Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor.

CAPÍTULO 3

Calor Húmedo:

El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones:

*El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas son producidas por reacciones que eliminan agua.

*El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire.

Antecedentes: El primer antecedente fue la marmita de Papin en 1681, semejante a una olla a presión que permitía mantener el agua por encima de los 100° C.

En 1830 William Henry, médico de Manchester; trataba ropa y otros utensilios provenientes de personas infectadas exponiéndolos en una vasija a vapor recalentado y aire caliente obteniendo el material libre de infección.

Pasteur en 1876, Koch y Wolffhugel en 1881 dan los fundamentos de la esterilización por calor seco y calor húmedo: 30 minutos a 110° - 120° C de exposición al vapor eran equivalentes a una hora de calor seco a 130° - 150° C.

En 1884 aparece en París con el nombre de Chamberland un equipo para usar en laboratorio, el que luego se masificaría en todos los laboratorios biológicos.

AUTOCLAVE

Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de Chamberland.

Esteriliza a 120º a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos.

Equipo:

Consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metálica, que en la parte inferior recibe calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica.

La caldera se cierra en la parte superior por una tapa de bronce sujetada por bulones, mariposas o charnelas. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manómetro, otro para el escape de vapor en forma de robinete (también llamado espita) y el tercero, para una válvula de seguridad que funciona por contrapeso o a resorte.

Funcionamiento y método para esterilizar adecuadamente en Autoclave:

Se coloca agua en la caldera, procurando que su nivel no alcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla o canasta de metal. Se cierra asegurando la tapa, ajustando los bulones y se da calor, dejando abierta la válvula de escape hasta que todo el aire se desaloje y comience la salida de vapor en forma de chorro continuo y abundante.

Se cierra la espita de vapor y se espera hasta que llegue a la temperatura adecuada. A partir de allí se cuenta el tiempo de esterilización, luego del cual se debe esperar al descenso de la temperatura para abrir la espita de purga y la tapa del autoclave nuevamente.

Este proceso de esterilización es el que mejor resultados dá en microbiología. El vapor de agua a fuerte presión actúa a mayores temperaturas:

Tiempos de esterilización en autoclave:

Del tiempo, temperatura y presión usados en la esterilización depende el éxito alcanzado. Generalmente los datos presión y temperatura son fijados, y el único factor que se varía es el tiempo. Los materiales necesitan diferentes tiempos de esterilización dependiendo de su textura, porosidad, y otras características propias de cada material. Algunos materiales como el hule, necesitan poco tiempo, mientras otros como el metal quirúrgico necesitan más. Los siguientes datos han sido tomados para una temperatura de esterilización de 250ºF (121ºC) a 15-20 PSI.

• Guantes de Caucho (Hule) 15 minutos

• Sondas (base tejida) 15 minutos

• Sondas (látex) 15 minutos

• Frascos de Vidrio, Cristalería en General 20 minutos

• Agua en frascos 20 minutos

• Jeringas de Vidrio 20 minutos

• Bandeja 30 minutos

• Equipo de transfusión 30 minutos

• Paquetes de maternidad 30 minutos

• Ropa 30 minutos

• Torundas 30 minutos

• Paquete quirúrgico 45 minutos

• Instrumental de acero inoxidable 45 minutos

*Cuando se esteriliza se deben hacer paquetes bien cerrados y bien ordenados, para que haya

buena penetración de vapor en el material.

No incluir dentro del mismo paquete material con diferentes tiempos de esterilización. Ej. : Lencería y Vidrio.

El método utilizado para envolver los paquetes deberá garantizar el mantenimiento de las condiciones de esterilidad de los materiales durante su almacenamiento.

Como Cargar el Autoclave

a) Se deben acomodar los bultos o paquetes de tal forma que haya una libre circulación de vapor entre ellos (no tratar de llenar el autoclave hasta sobrecargarlo).

b) Colocar de lado las botellas, frascos y cualquier clase de recipiente no poroso de material seco. Esto permite un pronto desplazamiento del aire y un rápido contacto del vapor con las superficies de las vasijas y su contenido. También facilita el secado.

c) Esterilizar los líquidos separándolos de otros materiales.

d) Cuando se esterilizan líquidos, debe hacerse con los recipientes destapados.

e) La cristalería deberá esterilizarse colocando los recipientes boca abajo u horizontales (nunca con la boca hacia arriba).

Tyndalización:

Esterilización por acción discontinua del vapor de agua, se basa en el principio de Tyndall Las bacterias que resisten una sesión de calefacción, hecha en determinadas condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma operación se repite con intervalos separados y en varias sesiones.

Se efectúa por medio del autoclave de Chamberland, dejando abierta la válvula de escape, o sea funcionando a la presión normal. Puede también realizarse a temperaturas más bajas, 56º u 80º para evitar la descomposición de las sustancias a esterilizar, por las temperaturas elevadas.

Ventajas del calor húmedo:

Desventajas:

Ebullición: Durante mucho tiempo se "hirvieron" los utensilios y materiales quirúrgicos o jeringas hipodérmicas para esterilizarlas. El agua a 100 °C no garantiza una adecuada esterilización, no obstante posee la propiedad de desprender las colonias o los microorganismos y destruir aquellos que son susceptibles a ésta temperatura.

Un claro ejemplo de ello fue el sistema utilizado hasta hace pocos años para esterilizar jeringas de vidrio y agujas hipodérmicas de níquel con embocadura de bronce ó en el mejor de los casos, platino, hirviéndolos en agua.

FILTRACIÓN: Este procedimiento es aplicable a la esterilización de líquidos y gases, especialmente los primeros. Cuando el líquido a filtrar no puede resistir, sin descomponerse , la acción del calor, se aplica la técnica de filtración, la que puede efectuarse mediante presión o aspiración.

Se basa en el pasaje de líquidos a través de sustancias porosas que detienen a los microbios. Los antiguos filtros se fabricaban en forma de bujías que son cilindros huecos abiertos por una extremidad y cerrados por otra, de paredes de espesor variable.

La filtración se reconoció como técnica de esterilización a partir de las observaciones de Koch en 1893, con la epidemia de cólera y la presencia del vibrión en el agua. Esta observación fue ilustrada en la epidemia Hamburgo-Altona en 1892. El agua del río Elba, que contenía Vibrio comma pasaba a las cañerías de agua de Hamburgo. Solo aparecieron unos pocos casos de cólera en el suburbio de Altona, donde el agua del Elba era filtrada por arenas (nótese el plural, refiriéndose tal vez a varios grados de arena), antes de su distribución.

Los filtros de porcelana se llaman "de Chamberland" y los de tierras infusorias calcinadas se denominan "Berkefield"

En la actualidad se usan membranas filtrantes con poros de un tamaño determinado. El tamaño del poro dependerá del uso al que se va a someter la muestra. Los filtros que se utilizan no retienen virus ni micoplasmas, estos últimos están en el límite de separación según el diámetro de poro que se utilice. La filtración se utiliza para emulsiones oleosas o soluciones termolábiles. Su usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnósticas, radiofármacos, medios para cultivos celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas.

Existen tres tipos básicos de filtros:

a- Filtros profundos o Filtros de profundidad:

Consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado, activado, o pegado dentro de los canales de flujo. En este tipo de filtros la retención de las partículas se produce por una combinación de absorción y de retención mecánica en la matriz.

b- Membranas filtrantes:

Tienen una estructura continua, y la retención se debe principalmente al tamaño de la partícula. Partículas más pequeñas al tamaño del poro quedan retenidas en la matriza del filtro debido a efectos electrostáticos.

La firma Millipore ha desarrollado membranas de 0,45  y 14 cm de diámetro, con un soporte de papel siliconado para su protección debido a la fragilidad de la misma, la ue debe ser monada en un soporte estéril y que permita el ingreso del líquido a esterilizar a presión.

c- Filtros de huella de nucleación (Nucleoporo):

Son películas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiación y sustancias químicas. Son filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente. Funcionan como tamices, evitando el paso de toda partícula con un tamaño mayor al del poro.

CAPÍTULO 5

MÉTODOS QUÍMICOS:

Estos métodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.

En comparación con los procedimientos físicos, éstos métodos tienen una importancia secundaria. Los antisépticos son considerados venenos protoplasmáticos que, al actuar sobre los gérmenes, los destruyen. Algunos de ellos ejercen su acción nociva sobre todas las células, por lo cual se les considera venenos generales, por el contrario otros actúan sobre algunas especies bacterianas, mostrándose como venenos específicos. Este método es óptimo para la antisepsia de las manos del operador, de locales, de mesas de trabajo, de jaulas de animales, y para destruir gérmenes que puedan caer en lugares de trabajo.

AGENTES QUÍMICOS

La Iodopovidona (pervinox), el Cloruro de Benzalconio (sal de amonio cuaternario o Cloruro de Zefirano) son ejemplos de antisépticos útiles para desinfectar manos y superficies. Cuando la superficie es resistente, el mejor agente biocida es el Hipoclorito de Sodio (agua lavandina).

ESTUFAS DE ESTERILIZACION POR OXIDO DE ETILENO

Destruye todos los organismos y microorganismos conocidos, incluso esporas y virus. Esteriliza sin deterioro artículos de goma, plástico, metal,madera, lana, piel, papel, productos farmacéuticos.

Esterilización con embalajes: a este gas son permeables sustancias como polietileno, nylon, celofán, etc.

En 1928, autores americanos: Bac, Cotton y Ellington; Schrader y Bossert y Autores alemanes: Gassner y Hase, descubrieron las propiedades del óxido de etileno.

En 1933 fueron certificadas las propiedades del óxido de etileno en un laboratorio de La Sorbona y en 1939 se estudió en un laboratorio de investigación del Ejercito de U.S.A.

El óxido de etileno era bactericida, esporicida, con gran poder de penetración, efectivo a bajas temperaturas y penetra sustancias porosas; para evitar su poder explosivo y su alto potencial inflamable se mezcló con CO2 en una proporción de 7,15 veces el volumen de óxido de etileno.

Trabajo de Phillips y Kaye.

El tiempo de esterilización que requiere el material depende de múltiples variables, el vacío que se produce, la humedad, la concentración del gas expresado en gs./l y la temperatura, es decir que reduciendo la temperatura aumenta el tiempo de exposición requerido.

El gas se adquiere en botellas metálicas o cartuchos que se vaporizan, cambian de líquido a gas a 10º C.

Todos los artículos deberán airearse por 6 hs. después de una esterilización.

El Oxido de etileno es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc.

Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica. Destruye todos los microorganismos incluso virus. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable (goma, plastico, papel, etc.), equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias, metal, etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo, y además cancerigeno.

Con aldehídos

Son agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas, provocando una modificación irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimática. Estos compuestos destruyen las esporas.

Glutaraldehído:

Consiste en preparar una solución alcalina al 2% y sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos.

Este método tiene la ventaja de ser rápido y ser el único esterilizante efectivo frío. Puede esterilizar plástico, goma, vidrio, metal, etc.

Formaldehído:

Se utilizan las pastillas de para formaldehido, las cuales pueden disponerse en el fondo de una caja envueltas en gasa o algodón, que después pueden ser expuesta al calor para un rápida esterilización (acción del gas formaldehído). También pueden ser usadas en Estufas de Formol, llamadas también de formalina, que son cajas de doble fondo, en cuya base se colocan las pastillas y se calienta hasta los 60° C y pueden esterilizar materiales de látex, goma,plásticos, etc.

Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 hs.

CAPÍTULO 6

RADIACIÓN:

Su acción depende de:

Radiaciones Ionizantes:

Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos, estructuras proteicas y lipídicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos.

Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar materiales termolábiles (termosensibles) como jeringas

descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos.

Rayos Ultravioleta:

Afectan a las moléculas de DNA de los microorganismos. Son escasamente penetrantes y se utilizan para superficies, se utilizan para la esterilización en quirófanos.

Rayos Gamma:

Su empleo esta basado en los conocimientos sobre la energia atomica. Este tipo de esterilización se aplica a productos o materiales termolábiles y de gran importancia en el campo industrial. Puede esterilizar antibióticos, vacunas, alimentos, etc.

Control de calidad: La correcta esterilización se puede controlar mediante dos métodos, siendo el segundo el más seguro.

Indicadores: Cintas comerciales que se colocan en el paquete o caja a esterilizar, que viran de color, cuando se alcanzan las temperaturas adecuadas para la esterilización.

Se describe la composición de los llamados "testigos de esterilización" preparadas por sustancias químicas.

1- Mezcla de Demande:

Safranina............... 0,01 g.

Benzonaftol........... 100,00 g.

Ésta mezcla se colorea de rojo cuando sufre una temperatura de 110 °C.

2- Mezcla de Gérard:

Fucsina................ 1 g.

Benzonaftol...........250 g.

Esta mezcla toma un color rojo rubí a 110 °C.

3. Verde Brillante......... 1 g.
   Acetanilida............100 g.
   Esta mezcla es azul a la temperatura ordinaria, a 115 °C toma un color verde oscuro)

Metil Violeta...........1 g.

Hidrato de Terpina....100 g.

Mezcla violeta pálido que a 117 °C se vuelve violeta oscuro.

Las mezclas se colocan en ampollas y se cierran a la lámpara, colocándose junto con el material a esterilizar.

Pruebas de cultivo:

También pueden colocarse gérmenes vivos, especialmente esporulados y los que presentan mayor resistencia como el bacilus subtilis o el b. Mesentericus de la papa (también responsable de la filamentación en el pan), esterilizándose conjuntamente con el material para luego sembrar una suspensión de los gérmenes para observarse en agar nutritivo a las 24 Hs. Si existe o nó desarrollo de colonias.

Bibliografía:http://www.monografias.com/trabajos24/esterilizacion-laboratorio/esterilizacion-laboratorio.shtml

         2.2.    Factores que intervienen en el proceso de esterilización.

El número de microorganismos: A mayor número de microorganismos que se tengan al inicio, mayor tiempo para eliminar la población entera.

Influencias ambientales: La presencia de materia orgánica regularmente inhibe la acción de antimicrobianos químicos. Microorganismos localizados en biopelículas, son difíciles de matar por biosidas, porque la actividad de éste es dependiente de la temperatura de la reacción química; los desinfectantes funcionan un poco mejor bajo temperaturas altas.

Tiempo de exposición: Los químicos antimicrobianos suelen requerir un mayor tiempo de exposición para microorganismos más resistentes o endoesporas, esto con el fin de que sea efectivo.

Características microbianas: Dependiendo las características del microorganismo se van a tener que usar diferentes métodos para poder eliminarlo.

http://es.wikipedia.org/wiki/Esterilizaci%C3%B3n_(microbiolog%C3%ADa)

  2.3. Establecimiento El Cultivo De Tejidos

E   El cultivo de tejidos –en su acepción amplia– puede ser definido como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos –células desprovistas de pared celular– células, tejidos u órganos) se cultiva asépticamente  en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. La imprecisión de esta definición puede generar muchas polémicas, pero es actualmente aceptada.

 

        2.3.1. Etapas del cultivo de tegidos    Fases del proceso de micropropagación

Dentro del proceso de micropropagación se pueden diferenciar varias fases o etapas:

• 1: Desinfección de las yemas de la planta y/o desinfección de semillas
• 2: Introducción del material seleccionado in vitro
• 3: Multiplicación de brotes
• 4: Enraizamiento
• 5: Aclimatación

Esta secuencia de etapas abarca el ciclo completo de la multiplicación de plantas in vitro y puede ser aplicada a diferentes especies vegetales  Preparación de la planta madre
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantos con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantos es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donante de yemas, durante un período que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.                Desinfección del material vegetal

Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantos. Los explantos pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de raíces o semillas. Antes de extraer los explantos se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener tales condiciones, se trabaja en cabinas de flujo laminar para extraer los explantos a partir del material vegetal. Estos explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de cultivo para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluída durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.       Introducción del material in vitro

Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.       Multiplicación de los brotes

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron las fases anteriores originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división de las plantas. El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.    Elección de un medio de enraizamiento de los explantos

Para enraizar los explantos se utilizan principalmente plantines individuales de un tamaño aproximado de 2 cm. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo de las auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.      Aclimatación de los explantos enraizados

Los explantos recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantos o plantines enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se plantarán en contenedores (almacigueras) cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada. La elección de un sustrato con buenas características físicas, es clave para el éxito de esta etapa. Para el trasplante, elegimos un sustrato suelto, poroso, con mezcla de arena turba, cáscara de arroz quemado , para permitir un desarrollo y crecimiento de raíces muy rápido. Las mezclas son diferentes y muy variadas de acuerdo a la especie con la que estamos trabajando. Luego de retirar cuidadosamente el agar de las raíces para evitar dañarlas, los plantines se enjuagan y se colocan en almacigueras con la mezcla de sustratos seleccionada y cubiertos con nylon. Todos los días se debe controlar el nivel de humedad en las almacigueras. Si es necesario, se aplica un riego con una pulverizadora manual, para mantener un ambiente húmedo a nivel del sustrato. A los 15 días del trasplante, se puede comenzar a levantar la cobertura de nylon en las horas de menor calor( temprano en la mañana o en la última hora de la tarde). Al comienzo las plantas se dejan media hora por día destapadas. A la semana siguiente se dejan destapadas durante una hora. Al mes del trasplante, se dejan tapadas durante la noche y si hay crecimiento de nuevas hojas, las plantas pueden permanecer destapadas. Las condiciones del cultivo in vitro , generan cambios en algunos aspectos anatómicos y fisiológicos de las plantas, por esta causa, durante la aclimatación, los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el estrés y tener mayor tasa de sobrevivencia.

        2.3.2. Selección de plantas madres

Etapa 1: Seleccionar como planta madre un individuo que reúna las características varietales deseadas, que se encuentre en adecuado estado fitosanitario y que haya sido pre-tratada conforme a un programa de fertilización y aplicación de pesticidas. Ajustar un protocolo de desinfección que permita obtener un gran porcentaje de explantos libres de contaminantes superficiales y endógenos. 

Etapa 2: obtención de yemas y/ o embrioides y en su multiplicación por repiques o subcultivos sucesivos (cada 20-25 días) a medio fresco. Esta etapa determina la disponibilidad y ampliación del stock comercial de plantas clonales. El material vegetal puede multiplicarse y mantenerse bajo condiciones de cultivo in vitro durante un tiempo prolongado. Resulta de fundamental importancia el renovar el stock introduciendo permanentemente material vegetal fresco (nuevos explantos) de manera de evitar la pérdida de la eficiencia y/o tasa de multiplicación debida a la senescencia de los explantos.

Etapa 3: transferencia de los brotes o yemas obtenidos y amplificados en la etapa previa a un medio de cultivo que promueva la diferenciación de raíces adventicias para la obtención de plantas íntegras capaces de sobrevivir bajo condiciones de cultivo en tierra.

Etapa 4: transferencia de las plantitas clonales a tierra o sustrato mezcla en maceta o terrinas bajo condiciones controladas, en un invernáculo. En esta etapa se produce la formación de raíces adventicias. En las especies herbáceas es relativamente fácil mientras que en muchas especies leñosas resulta más complicada por su limitada capacidad rizogénica.

Elección del explanto: cualquier tejido u órgano vegetal puede ser usado como explanto iniciador del cultivo in vitro. El grado de éxito dependerá del sistema de cultivo utilizado, de la especie vegetal en cuestión y de la adecuada desinfección superficial inicial del material vegetal. El primer objetivo de la etapa I consiste en obtener un gran porcentaje de explantos libres de patógenos superficiales. Los explantos más utilizados para iniciar la propagación clonal in vitro de una planta son las yemas apicales del vástago, estacas uninodales portando yemas axilares, discos de hoja, secciones de raíz y meristemas. En general, los órganos jóvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. Es importante además disminuir el daño mecánico durante el aislamiento del explanto, ya que éste puede asociarse a la liberación de compuestos fenólicos que pueden inhibir el crecimiento e incluso matar al explanto.

Como paso preliminar al uso de soluciones desinfectantes resulta en muchos casos ventajoso lavar el material vegetal bajo agua corriente (entre 30 minutos hasta 2 horas) de manera de reducir la posible carga de contaminantes que portan los explantos. Esto resulta particularmente aconsejable cuando se trata de explantos pubescentes, órganos de reserva (tubérculos, bulbos) o raíces. Este lavado puede ser precedido por el uso de una solución jabonosa. Otros desinfectantes de amplio uso en cultivo de tejidos vegetales son el peróxido de hidrógeno y el nitrato de plata. La elección del orden de dilución del desinfectante así como el tiempo de exposición del material vegetal a dicha solución dependerá del tipo de explanto y de su estado fitosanitario de partida (por ejemplo si se trata de material que viene de campo o de cultivo controlado bajo invernáculo, etc.). Una vez ajustadas estas variables de logrará La esterilización superficial del material a establecer in vitro. En el caso de contaminaciones bacterianas endógenas resultará necesario el uso de antibióticos adicionados al medio de cultivo.

Una vez establecido el cultivo in vitro pueden esperarse diferentes respuestas que van desde la muerte del explanto por la utilización de un medio de cultivo inadecuado; la contaminación del material por sobre-crecimiento de algún microorganismo endógeno o por un deficiente tratamiento de desinfección superficial; la regeneración indirecta a partir de la formación de callo por proliferación de las células desdiferenciadas, resultado de sucesivas mitosis o, por último, la aparición de brotes o embriones somáticos directamente a partir del explanto inicial sin previa formación de callo. La regeneración de brotes, yemas, primordios de raíz o embriones somáticos estará determinada fundamentalmente por el balance de reguladores del crecimiento adicionados al medio sintético de cultivo.

        2.3.3. Explante

   varios factores deben ser tenidos en cuenta en la elección del explante apropiado para el establecimiento de los cultivos in vitro, entre ellos: el explante original deberá posibilitar la inducción de la embriogénesis somática. En este caso, la utilización de embriones zigóticos inmaduros u hojas, suelen ser frecuentescomo explantes.

• Obtención de híbridos interespecí-ficos. Una de las primeras aplicaciones delcultivo de tejidos en la agricultura lo constituyó su empleo como ayuda para la obtención de híbridos derivados de cruzamientos interespecíficos, donde se produce el aborto temprano de embriones. En estos casos, el explante cultivado es el embrión cigótico en estadios tempranos de su desarrollo. Con lamisma finalidad también se utilizan ovariosu óvulos fecundados.• Obtención de plantas de semillas conembriones rudimentarios. Para esta finalidad los explantes pueden ser semillas (porej. orquídeas) o bien, se aíslan los embrionesen un estado temprano de desarrollo («corazón») como en el caso de yerba mate o  dealgunas variedades de duraznero.

           cuando la planta ha crecida demasiado;

2) cuando el sustrato está podriendo o en todo caso deteriorado y siempre queda demasiado estofado o todo pegado;

3) cuando está infestado de parásito o de mohos.

Cuando se tienen uno o mas de estos casos se tiene que proceder al trasplante.

En qué período se trasplante

Si se procede al trasplante a causa de una maceta demasiada pequeña, se aconseja proceder al trasplante después de la floración, al principio de la nueva estación vegetativa, cuando brotan las primeras raíces (y que sean largas al menos 2-3 cm).

Preliminares al trasplante

En primer lugar, la tierra que contiene la orquídea debe ser mojada para lograr raíces más elásticas y evitar las roturas. Las raíces deben ser limpiadas de todo el material que tenga pegado y las raices muertas deben ser extirpadas con cizallas qué habremos desinfectado previamente con alcohol o lejía o preferiblemente a la llama.

Si al momento de extraer la maceta las raíces están muy adheridas a la maceta, es oportuno sumergir la maceta por unos 30 minutos en agua ligeramente tibia. Si esta técnica no funzionara, entonces corte la maceta. No forze las raíces que podrían perjudicarse.

Proceder con gran cautela y traten de molestar lo menos posible las raíces y sólo eliminen  las raíces muertas. Las superficies de canto deben ser tratadas con polvos fungicidas de amplio espectro qué encontrarán de un buen viverista.

El trasplanto también puede aprovecharse para una eventual división de la planta de orquídea.

        2.3.5. Condiciones de incubación

 

La incubación de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo menos en lo que se refiere a temperatura calidad e intensidad de luz, fotoperíodo, humedad atmosférica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cámaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor), una buena y uniforme circulación de aire en el interior, dotados de un buen sistema de alarma para interrumpir la iluminación en caso de no funcionar el aire acondicionado. 

En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 oC, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lámparas fluorescentes del tipo «luz día» con una irradiancia de entre 50 y 200μmol.m-2.s-1.La humedad atmosférica debe ser elevada (80-90%).

  

  

        

         BLIBLIOGRAFIA

Crecimiento en condiciones controladas.

Crecimiento en condiciones de asepsia.

Alta humedad relativa.

Estomas no funcionales ya que no cierran y por lo tanto el agua se escapa.

Ausencia de pelos radiculares

 Consejo argentino para la información y el desarrollo de la biotecnología. 2007. http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php?action=cuaderno&opt=5&tipo=1&note=56

 Cultivo in vitro en especies del género Pinus. http://www.ilustrados.com/tema/395/Cultivo-vitro-especies-genero-Pinus.Historia de cultivo de tejidos. 2007. http://natalymosquera.blogspot.mx/

Segretin Maria Eugenia. Los cultivos celulares y sus aplicaciones (cultivos de células vegetales).